Kdy používat ke krájení vzorku vibratom

vytvořeno: 28.8.2020

Kdy používat ke krájení vzorku vibratom

V tomto článku se budeme zabývat výhodami a omezeními vibračních mikrotomů, tzv. vibratomů.

Protože je Leica Biosystem předním výrobcem všech hlavních typů mikrotomů, kryostatů, sáňkových mikrotomů, rotačních mikrotomů a vibračních mikrotomů, dostáváme spoustu otázek, jako například:

který z mikrotomů je pro danou aplikaci nejvhodnější,

který mikrotom lze využít na co nejširší spektrum aplikací v případě, že si zákazník může koupit pouze jeden typ,

proč je pro danou aplikaci doporučen právě určitý druh mikrotomu, atd.

Různé typy mikrotomů vyžadují různé úpravy tkáně, ať už zmražením, nebo zalitím do parafínu. Důvodem je, že nehledě na ostrost, je čepel mikrotomu tlačena dopředu do bloku a měkké tkáně by se spíše stlačily, než ukrojily. Jestliže dojde k dostatečnému stlačení tkáně, tkáň se náhle prořízne. Neřeže se však přímo skrz, jelikož zkosení čepele a nerovnoměrné tlačení při krájení způsobuje odchylky. Měkké tkáně však lze řezat rychlým pohybem čepele dozadu a dopředu, čímž se vytvoří rovnoměrný řezací efekt i při pomalém pohybu čepele vpřed. Proč tedy krájet měkké tkáně?

Výhody vibračního mikrotomu:

nepoškozuje buněčné membrány, cytosol zůstává v buňkách

barvení je ostřejší, protože v extracelulární tkáni není cytosol; lepší pro HRP, atd.

buňky mohou zůstávat živé, jelikož tkáň může být během krájení okysličována médiem

rychlé zpracování, tkáň stačí přilepit na platformu

Nevýhody vibračního mikrotomu:

práce s vibratomem je mnohem pomalejší než s kryostatem nebo rotačním či sáňkovým mikrotomem

řezy musí být silné, 50 mikronů a více

tkáňový blok, ze kterého jsou odebírány řezy, nesmí být příliš silný (vysoký)

Problémy vyskytující se při krájení na vibračním mikrotomu

Úhel čepele

Sklon čepele může být nastaven na libovolný úhel. Správný úhel čepele závisí pouze na vlastnostech čepele. Důsledky nesprávného úhlu čepele se však liší v závislosti na vlastnostech řezaného materiálu. Viz obrázek níže:

   

Tento obrázek ze staré příručky ve skutečnosti ukazuje nesprávný úhel čepele a tzv. úhel vůle – viz článek Nastavení úhlu nože či žiletky u mikrotomu. Úhel čepele je úhel mezi tělem čepele a směrem pohybu. Všimněte si, že na přední hraně čepele je zkosení. To je nezbytné při výrobě nožů. Úhel vůle (clearence angle) je úhel mezi spodním zkosením a směrem pohybu. Úhel čepele nutí tkáň, aby se ohýbala nahoru na přední stranu čepele. To komprimuje buňky na jedné straně sekce v ohybu a natahují se na druhou stranu. Toto zkosení by mělo být vždy minimalizováno. Pokud je však úhel čepele nulový, bude úhel vůle záporný, protože zkosení na konci nože je zde stále přítomno. Při pohybu vpřed bude zadní část spodního zkosení tlačit dolů a stlačovat tak blok a tkáň. To je vysoce nežádoucí pro jakoukoli aplikaci. Aby se tomuto riziku zabránilo, musí být úhel mezi zkosením na ostří a dráhou posuvu nad nulou. Na nule by ovšem stále existovalo nějaké tření čepele o tkáň. Úhel asi 1 ° by byl perfektní. Neexistuje žádný případ při krájení, kdy je více než 1 ° výhodné. Na obrázku si všimněte, že je úhel vůle asi 10-15 stupňů, a tak se tkáň ohýbá více, než je nutné. Správný úhel čepele je tedy závislý na úhlu zkosení použité čepele, vždy je dobré, aby spodní zkosení čepele netlačilo na řezanou tkáň.

Amplituda oscilace

Z mechanických důvodů přístroje, které mají co do činění s přirozenou frekvencí kmitání, není vhodné urychlovat pohyb oscilace tam a zpět ve stejném rozsahu. Avšak zvýšení amplitudy oscilace s každou oscilací stále na stejné frekvenci může mít za následek, že se čepel  bude pohybovat po tkáni rychleji. Tento způsob (zvýšení amplitudy) je možné použít, dokud v extrémních případech větší amplituda neroztrhne tkáň nebo nezpůsobí vertikální vibrace čepele. Pro tkáně, které mají sklony ke komprimaci, je toto nastavení vyšší amplitudy vhodnější.

Rychlost dopředu

Pokud čepel nože vyklouzne z tkáňového bloku nebo příliš stlačuje tkáň, vyzkoušejte pomalejší postup. Pro nejkritičtější aplikace, jako je např. duální fluorescenční zobrazování vápníku v řezech živé tkáně, platí čím pomalejší postup, tím lepší výsledek. V některých případech trvá řez až 10 minut, Jestliže chceme tkáň udržet stále na živu i během krájení řezu, trvá v některých případech řez až 10 minut. Kompromisem je rychlost provedení práce vs. kvalita sekce.

Příliš silné nebo tenké řezy

Pokud nástroj krájí řezy různé tloušťky tkáně, tedy tlusté nebo tenké, existuje několik možných příčin:

úhel vůle je záporný nebo je příliš nízký úhel čepele 

některé části nástroje jsou uvolněny 

podstavec, tkáň na něm nebo čepel nejsou pevně zajištěny

další možnou příčinou může být,  že má tkáň příliš vysokou výšku a příliš se nahoře ohýbá, takže se pohybuje až příliš; pokud je to možné, odřízněte výšku bloku na menší

Doporučuje se řešit možné příčiny vzniku postupně a se zvýšenou opatrností tak, aby nedošlo k pořezání laboranta.

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací