V tomto článku se budeme zabývat výhodami a omezeními vibračních mikrotomů, tzv. vibratomů.
Protože je Leica Biosystem předním výrobcem všech hlavních typů mikrotomů, kryostatů, sáňkových mikrotomů, rotačních mikrotomů a vibračních mikrotomů, dostáváme spoustu otázek, jako například:
• který z mikrotomů je pro danou aplikaci nejvhodnější,
• který mikrotom lze využít na co nejširší spektrum aplikací v případě, že si zákazník může koupit pouze jeden typ,
• proč je pro danou aplikaci doporučen právě určitý druh mikrotomu, atd.
Různé typy mikrotomů vyžadují různé úpravy tkáně, ať už zmražením, nebo zalitím do parafínu. Důvodem je, že nehledě na ostrost, je čepel mikrotomu tlačena dopředu do bloku a měkké tkáně by se spíše stlačily, než ukrojily. Jestliže dojde k dostatečnému stlačení tkáně, tkáň se náhle prořízne. Neřeže se však přímo skrz, jelikož zkosení čepele a nerovnoměrné tlačení při krájení způsobuje odchylky. Měkké tkáně však lze řezat rychlým pohybem čepele dozadu a dopředu, čímž se vytvoří rovnoměrný řezací efekt i při pomalém pohybu čepele vpřed. Proč tedy krájet měkké tkáně?
Výhody vibračního mikrotomu:
• nepoškozuje buněčné membrány, cytosol zůstává v buňkách
• barvení je ostřejší, protože v extracelulární tkáni není cytosol; lepší pro HRP, atd.
• buňky mohou zůstávat živé, jelikož tkáň může být během krájení okysličována médiem
• rychlé zpracování, tkáň stačí přilepit na platformu
Nevýhody vibračního mikrotomu:
• práce s vibratomem je mnohem pomalejší než s kryostatem nebo rotačním či sáňkovým mikrotomem
• řezy musí být silné, 50 mikronů a více
• tkáňový blok, ze kterého jsou odebírány řezy, nesmí být příliš silný (vysoký)
Problémy vyskytující se při krájení na vibračním mikrotomu:
Úhel čepele
Sklon čepele může být nastaven na libovolný úhel. Správný úhel čepele závisí pouze na vlastnostech čepele. Důsledky nesprávného úhlu čepele se však liší v závislosti na vlastnostech řezaného materiálu. Viz obrázek níže:
Tento obrázek ze staré příručky ve skutečnosti ukazuje nesprávný úhel čepele a tzv. úhel vůle – viz článek Nastavení úhlu nože či žiletky u mikrotomu. Úhel čepele je úhel mezi tělem čepele a směrem pohybu. Všimněte si, že na přední hraně čepele je zkosení. To je nezbytné při výrobě nožů. Úhel vůle (clearence angle) je úhel mezi spodním zkosením a směrem pohybu. Úhel čepele nutí tkáň, aby se ohýbala nahoru na přední stranu čepele. To komprimuje buňky na jedné straně sekce v ohybu a natahují se na druhou stranu. Toto zkosení by mělo být vždy minimalizováno. Pokud je však úhel čepele nulový, bude úhel vůle záporný, protože zkosení na konci nože je zde stále přítomno. Při pohybu vpřed bude zadní část spodního zkosení tlačit dolů a stlačovat tak blok a tkáň. To je vysoce nežádoucí pro jakoukoli aplikaci. Aby se tomuto riziku zabránilo, musí být úhel mezi zkosením na ostří a dráhou posuvu nad nulou. Na nule by ovšem stále existovalo nějaké tření čepele o tkáň. Úhel asi 1 ° by byl perfektní. Neexistuje žádný případ při krájení, kdy je více než 1 ° výhodné. Na obrázku si všimněte, že je úhel vůle asi 10-15 stupňů, a tak se tkáň ohýbá více, než je nutné. Správný úhel čepele je tedy závislý na úhlu zkosení použité čepele, vždy je dobré, aby spodní zkosení čepele netlačilo na řezanou tkáň.
Amplituda oscilace
Z mechanických důvodů přístroje, které mají co do činění s přirozenou frekvencí kmitání, není vhodné urychlovat pohyb oscilace tam a zpět ve stejném rozsahu. Avšak zvýšení amplitudy oscilace s každou oscilací stále na stejné frekvenci může mít za následek, že se čepel bude pohybovat po tkáni rychleji. Tento způsob (zvýšení amplitudy) je možné použít, dokud v extrémních případech větší amplituda neroztrhne tkáň nebo nezpůsobí vertikální vibrace čepele. Pro tkáně, které mají sklony ke komprimaci, je toto nastavení vyšší amplitudy vhodnější.
Rychlost dopředu
Pokud čepel nože vyklouzne z tkáňového bloku nebo příliš stlačuje tkáň, vyzkoušejte pomalejší postup. Pro nejkritičtější aplikace, jako je např. duální fluorescenční zobrazování vápníku v řezech živé tkáně, platí čím pomalejší postup, tím lepší výsledek. V některých případech trvá řez až 10 minut, Jestliže chceme tkáň udržet stále na živu i během krájení řezu, trvá v některých případech řez až 10 minut. Kompromisem je rychlost provedení práce vs. kvalita sekce.
Příliš silné nebo tenké řezy
Pokud nástroj krájí řezy různé tloušťky tkáně, tedy tlusté nebo tenké, existuje několik možných příčin:
• úhel vůle je záporný nebo je příliš nízký úhel čepele
• některé části nástroje jsou uvolněny
• podstavec, tkáň na něm nebo čepel nejsou pevně zajištěny
• další možnou příčinou může být, že má tkáň příliš vysokou výšku a příliš se nahoře ohýbá, takže se pohybuje až příliš; pokud je to možné, odřízněte výšku bloku na menší
Doporučuje se řešit možné příčiny vzniku postupně a se zvýšenou opatrností tak, aby nedošlo k pořezání laboranta.