Jak zjistíme
že bude protilátka vykazovat zkříženou reaktivitu?

vytvořeno: 30.9.2020

Jak zjistíme, že bude protilátka vykazovat zkříženou reaktivitu?

Ke zkřížené reaktivitě dochází tehdy, kdy protilátka připravená proti jednomu konkrétnímu antigenu rozeznává dva antigeny s podobnou regionální strukturou.

Co je zkřížená reaktivita?

Afinita protilátky ke specifickému antigenu je determinována specifickou aminokyselinovou sekvencí dané protilátky, tzv. Fab regionem. Ke zkřížené reakci dochází, pokud protilátka připravená proti specifickému antigenu vykazuje vysokou afinitu i vůči antigenu jinému. Častým příkladem je případ, kdy protilátka rozeznává podobnou regionální strukturu.

Zkřížená reaktivita může zcela popřít výsledek experimentu, a mít tak dopad na vědeckou reprodukovatelnost. Proto je testování protilátek na zkříženou reaktivitu s podobnými proteiny kritickým krokem pro validaci experimentu.

Jaké jsou hlavní rozdíly mezi primárními a sekundárními protilátkami?

Polyklonální protilátky Monoklonální protilátky
Směs molekul imunoglobulinů, které jsou vyplavovány proti konkrétnímu antigenu. Homogenní populace protilátek, které jsou produkovány jedním klonem plazmatických B buněk.
Produkovány různými klony plazmatických B buněk. Produkovány stejným klonem plazmatických B buněk.
Produkce nevyžaduje hybridomovou buněčnou linii. Produkce vyžaduje hybridomovou buněčnou linii.
Heterogenní populace protilátek Homogenní populace protilátek
Interagují s různými epitopy na stejném antigenu. Interagují s konkrétním epitopem na antigenu.

Jak zkontrolovat křížovou reaktivitu 

Křížová interakce není vždy známkou špatné kvality. Někdy může využitelnost protilátky dokonce zlepšit. Například křížová interakce protilátky s cílem napříč druhy umožňuje použít stejnou protilátku na více modelových organismů.

Zkřížená reaktivita se často vyskytuje u protilátek odvozených od lidských antigenů. 

Na základě homologie proteinové sekvence a publikací používajících jiné než lidské organismy, může být řada protilátek použita nejen na lidské vzorky, ale také na celou řadu organismů. Homologie může být zjištěna s použitím srovnání sekvencí (tzv. pairwise sequence alignment) imunogenu a cílového antigenu prostřednictvím webu NCBI-BLAST. Další informace mohou být zjištěny na univerzálním zdroji informací o proteinech, webové stránce UniProt.

Reaguje moje protilátka také s jinými druhy?

To, zda bude má protilátka reagovat také s jinými druhy, záleží na míře podobnosti proteinové sekvence mezi imunogenem a potenciálně cross-reagující proteinovou sekvencí.

Co je „správné číslo“ pro homologii a predikci křížové reaktivity?

Naší* zkušeností je, že pokud imunogen a sekvence potenciálně cross-reagujícího proteinu sdílí 75 % sekvenční homologie, dá se zkřížená reaktivita skutečně očekávat. Pokud je váš vzorek jiného než lidského původu, doporučuje se použít polyklonální protilátku, protože bude rozeznávat směs epitopů.

Jak se vyhnout křížové reaktivitě u Western Blotu?

Pokud je to možné, doporučuje se používat sekundární protilátku specifickou vůči používané protilátce primární. Například když je primární protilátka myšího původu, sekundární protilátka by měla být směřována proti myším IgG. V případě, že je sekundární protilátka polyklonální a připravená proti celé molekule IgG, pak králičí protilátka rozpoznávající primární myší protilátku nemusí být dobrou volbou k rozpoznání běžného regionu lehkého řetězce kappa. 

Jak se vyhnout křížové reaktivitě u imunobarvení?

Ke zkřížené reaktivitě může docházet při imunobarvení používajícím vzorky odvozené z tkání. Proto se běžně před použitím celých protilátek preferují jako primární protilátky protilátkové fragmenty (například při použití myších protilátek na myší tkáň.). 

Preabsorbovaná sekundární protilátka a zkřížená reaktivita

Preabsorbované sekundární protilátky jsou takové polyklonální protilátky, při jejichž přípravě byl použit další purifikační krok s cílem odfiltrovat protilátky, které se váží na imunoglobuliny nespecificky. Tento proces může snížit mezidruhovou zkříženou reaktivitu a zvýšit specifitu protilátky. V závislosti na nastavení experimentu jsou dostupné varianty preabsorbovaných a vysoce preabsorbovaných sekundárních protilátek.

Jak sekundární protilátky správně vybírat a tipy, co při výběru zvážit, jsme shrnuli do článku Jak si vybrat sekundární protilátku.

 

* Zdroj: https://www.ptglab.com/news/blog/how-do-i-know-if-the-antibody-will-cross-react/

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací