Při používání imunochemických metod klademe velký důraz na výběr primární protilátky. Studujeme příbalové letáky a obrázky v nich. Kontrolujeme, zda je daná primární protilátka vhodná pro aplikaci a cílový organismus. Vyhledáváme, zda již byla použita v publikaci. Ale co sekundární protilátka? Věnujeme vždy stejnou pozornost výběru protilátky sekundární?
Právě z tohoto důvodu jsme si pro Vás připravili této materiál s cílem shrnout aspekty vhodné ke zvážení při výběru sekundární protilátky. Věříme, že Vám některé z uvedených tipů pomohou zorientovat se v tématu.
Co je sekundární protilátka:
Sekundární protilátka je protilátka, která se neváže přímo na stanovovaný antigen, ale na protilátku primární. K detekci antigenů je možné použít přímo primární protilátku konjugovanou se značkou, nicméně použití sekundárních protilátek přináší celou řadu výhod. Např. specifita sekundární protilátky k oblastem primární protilátky umožňuje vazbu více sekundárních protilátek na primární protilátku, čímž dochází k amplifikaci signálu a zvýšení citlivosti metody. Nespornou výhodu představuje možnost konjugace sekundární protilátky s řadou barevných značek nebo enzymů. Konjugace protilátek s detekční molekulou nám dávají značnou flexibilitu a různorodost experimentů a umožňují detekci, sortování i purifikaci cílových proteinů. Využití univerzálních sekundárních protilátek je též ekonomičtější variantou. Nejenže je výroba značených primárních protilátek poměrně nákladná. Navíc může přítomnost samotné značky způsobit nefunkčnost protilátky jako takové.
Jak je charakterizována funkčnost sekundární protilátky?
- Důležitým parametrem sekundární protilátky je specifita neboli míra detekce primární protilátky.
- Senzitivitou označujeme množství antigenu, které je možné protilátkou detekovat. Senzitivita není závislá jen na vazebné afinitě, ale i na značení protilátky.
- Konzistencí protilátky označujeme schopnost protilátky dosahovat opakovatelných výsledků s využitím různých šarží. Přímý vliv na konzistenci má zdroj protilátky a její klonalita (polyklonální vs. monoklonální).
Struktura protilátky
Protilátka je protein připomínající tvarem písmeno Y. Skládá se ze 4 polypeptidových řetězců – ze 2 identických těžkých řetězců (H, heavy) a 2 identických lehkých řetězců (L, light) (Obr. 1). Oba těžké řetězce jsou spojeny k sobě v pantové oblasti (Hinge region). V tomto místě je možné protilátku rozštěpit pomocí papainu na části Fc a Fab. Krystalizační region Fc (Fragment crystallizable) je úsek důležitý pro funkci protilátky v imunitní odpovědi. V rámci jednotlivých protilátek se Fc region příliš neliší. Regiony Fab (fragment antigen-binding) hrají roli ve vazbě samotného antigenu. Při bližším pohledu na region Fab můžeme vidět, že je protilátka v tomto místě tvořena doménou variabilní (V, variable) a konstantní (C, constant). Právě variabilní regiony jsou části řetězců, kterými se liší jednotlivé protilátky a jsou zodpovědné za specifické rozpoznání antigenu.
Výběr sekundární protilátky
Příprava sekundárních protilátek je prováděna imunizací zvířete jinou protilátkou (z odlišného zvířecího druhu). Specifita produkované sekundární protilátky je tudíž determinována charakterem imunizačního antigenu, tj. touto cestou je určena specifita sekundární protilátky vůči zvířecímu organismu, podtřídě protilátky a fragmentu.
1. Hostitelský organismus a reaktivita
Prvním krokem při výběru sekundární protilátky je výběr hostitelského organismu. Potřebujeme najít takovou protilátku, která bude reagovat s naší primární protilátkou; neboli se zvířecím organismem ve kterém byla připravena primární protilátka. Např. máme-li primární protilátku připravenou v myši (mouse), sekundární protilátka musí být mířena proti myši (anti-mouse). Jako hostitelský organismus pak označujeme zvíře, v kterém byla sekundární protilátka připravena. Použijeme-li náš příklad, sekundární protilátka zde musí být vyrobena z jiného zvířete, než je myš tedy např. z kozy (Obr.2).
Nejčastěji jsou používané sekundární protilátky mířené proti myši (anti-mouse), králíkovi (anti-rabbit), kryse (anti-rat), křečkovi (anti-hamser) a morčeti (anti-Guinea Pig). Tak tomu je v případě použití polyklonálních primárních protilátek. Použijeme-li primární protilátku monoklonální, bude sekundární protilátka nejčastěji mířena na myš (anti-mouse).
Je třeba též myslet na to, aby se hostitelský organismus primární protilátky lišil od typu vzorku, se kterým pracujeme.
Obr.2: Schéma výběru hostitelského organismu sekundární protilátky. Lidský antigen je rozpoznán myší primární protilátkou mířenou proti lidskému organismu. Primární protilátka následně slouží jako antigen a je rozpoznána kozí sekundární protilátkou mířenou proti myšímu organismu.3
2. Výběr konjugované detekční molekuly
Pro imunochemické metody bývají protilátky konjugované s detekční molekulou. Výběr konkrétního konjugátu se odvíjí přímo od používané metody (Obr. 3).
Obr. 3: Příklady značek dle imunochemických metod. (Seznam zkratek je uveden na konci článku.)
Pro techniku ELISA a western blot (WB) jsou nejoblíbenější variantou enzymaticky značené sekundární protilátky, nejčastěji křenovou peroxidázou (horseradish peroxidase, HRP) a alkalickou fosfatázou (alcalic phosphatase, AP). HRP je v porovnání s AP ekonomičtější a stabilnější variantou. Pro své vlastnosti se stala populární zvláště v chemiluminiscenční detekci. AP však vykazuje zvýšenou senzitivitu, tudíž si své místo nalezla častěji v detekcích kolorometrických. Další alternativou k enzymatickému značení je značení biotinem. Schopnost avidinu a streptavidinu vázat se na biotin a formovat komplex umožňuje až čtyřnásobnou amplifikaci signálu, a to nezávisle na hostitelském druhu sekundární protilátky.
Pro metodu průtokové cytometrie a imunofluorescenční barvení (IF) jsou využívány sekundární protilátky značené fluorescenční molekulou, např. Alexa Fluor, DyLight, FITC, TRITC a jiné (Seznam zkratek je uveden na konci článku.). Při výběru fluorescenční značky je třeba zvážit excitační a emisní spektrum fluorochromu pro daný experiment. Fluorescenční značky jsou oblíbené zvláště při imunofluorescenční detekci několika antigenů současně. Vyžadována je vhodná kombinace sekundárních protilátek, aby nedošlo k překryvu mezi jednotlivými kanály (Obr. 4). Pro tyto účely je vhodné využívat fluorescenční protilátky s úzkým emisním spektrem. Samozřejmostí je použití vhodného záznamového přístroje (mikroskop, scanner, atd.)
Obr. 4.: Grafické znázornění fluorescenčních emisních spekter protilátek značených fluorochromem Alexa Fluor.1
Fluorescenční protilátky jsou využívány též při metodě WB. V porovnání s chemiluminiscenční detekcí WB na principu enzym/substrát, kde může být síla signálu výrazně ovlivněna kinetikou probíhající reakce, je hlavní výhodou florescenčně značených protilátek IRDye možnost detekce více než jednoho proteinu. Signál je zde přímo úměrný množství cílového proteinu, což umožňuje snadnou kvantifikaci. Další pozitivní stránkou použití protilátek IRDye v detekci antigenů při WB je stabilita vzniklého komplexu, možnost skladování membrány a její znovu zobrazení. Bohužel zde nesmíme zapomínat na vyšší pořizovací náklady na značené protilátky a v neposlední řadě náklady na přístrojového vybavení.
Poslední typ konjugované značky, který zde zmíníme, je spojení protilátky se zlatými nanočásticemi o rozdílné velikosti. Příkladem takové aplikace je elektronová mikroskopie.
3. Třída a podtřída protilátek
Na základě struktury jsou protilátky děleny do jednotlivých tříd a podtříd. Variace v oblasti Fc fragmentu těžkého řetězce nám rozděluje protilátky do těchto tříd: IgA (1-2), IgD, IgE, IgG (1-4) a IgM (Tab 1). Těžké řetězce jsou následně označovány korespondujícím písmenem z řecké abecedy: α, δ, ε, μ a ϒ. Isotypy IgG a IgA mohou být dle odlišností v těžkém řetězci dále děleny do podtříd. Podobně jako je tomu u těžkých řetězců, lehké řetězce jsou rozdělovány na lambda (λ) a kappa (κ). Přítomen může být vždy jen jeden typ řetězce – λ nebo κ.
| Isotyp nebo třída: | IgG (ϒ těžký řetězec), IgM(μ) IgA (α), IgE (ε), IgD (δ) |
| Podtřída: | IgG1 (ϒ1 těžký řetězec), IgG2 (ϒ2), IgG3 (ϒ3), IgG4 (ϒ4), IgA1(α 1), IgA2 (α2) |
| Typy: | λ a κ lehký řetězec |
Tab. 1.: Lidské imunoglobuliny – isotypy, podtřídy a typy
Sekundární protilátky musí být mířeny proti isotypu protilátky primární. Např. pro myší primární protilátku IgM budeme volit sekundární protilátku anti-mouse detekující IgM.
Další základní otázka během výběru sekundární protilátky zní: Je vaše primární protilátka polyklonální či monoklonální? Polyklonální protilátky obsahují směs několika isotypů imunoglobulinu G (např. IgG1, IgG2a). Pro zlepšení detekce cílového proteinu je tudíž nejlepší použít sekundární protilátku, která rozliší veškeré isotypy, neboli sekundární protilátky IgG H+L.
Naproti tomu monoklonální primární protilátky obsahují pouze jeden isotyp imunoglobulinu. Proto je důležité použít sekundární protilátku specificky rozeznávající daný isotyp. Tento údaj bývá uveden v příbalovém letáku primární protilátky.
Z výše uvedeného vyplývá, že nejčastější primární a sekundární protilátky bývají vyráběny ve variantě IgG. S jinými typy se setkáme spíše příležitostně. Protilátky specifické pro jednotlivé podtřídy mohou být využity pro rozlišení mezi primárními protilátkami při několikanásobném barvení.
4. Preabsorbované protilátky
Preabsorbce protilátky představuje přídatný purifikační krok pro zvýšení specifity dané protilátky. Princip purifikace spočívá v průtoku sekundární protilátky kolonou, která obsahuje matrici s imobilizovanými proteiny ze séra potenciálních zvířecích druhů, které by mohly s danou protilátkou zkříženě reagovat. Nespecifické protilátky jsou zachycovány na koloně, zatímco vysoce specifické sekundární protilátky volně protékají. Stupeň křížové-reaktivity je následně sledován metodou ELISA nebo WB. Obvykle dosahuje hodnoty 1%. V případě výběru preabsorbovaných protilátek vybíráme takovou, aby byla absorbovaná zvířecím druhem, který detekujeme. Např. studujeme-li vzorky lidské tkáně, vybereme sekundární protilátku, která nebude rozpoznávat lidské proteiny, protože tento druh vazby způsobuje falešně pozitivní výsledky nebo vysoké pozadí.
Použití preabsorbovaných protilátek je doporučené při imunohistochemickém barvení vzorku s vysokým podílem endogenních imunoglobulinů. Pro tyto experimenty používáme sekundární protilátku preabsorbovanou proti stejnému druhu, jakým je vzorek. Použitím preabsorbovaných protilátek je redukována křížová interakce mezi sekundární protilátkou a endogenní IgG a sníženo nespecifické pozadí.
Pro zredukování nespecifické interakce můžeme též blokovat pozadí sérem ze stejného druhu, jako je použitá sekundární protilátka.
5. Afinitně purifikované protilátky nebo IgG frakce
Dalším rozhodovacím kritériem je míra čistoty protilátky. V experimentech máme možnost využít kompletní IgG frakci nebo afinitně purifikované protilátky.
Nepurifikované IgG frakce obsahující celý komplex imunoglobulinů. Celá frakce je většinou získána prostřednictvím izolace Proteinem A. Protilátky mohou být následně afinitně purifikované pro odstranění protilátkových podtříd nebo antigen-nespecifických protilátek ze vzorku. Tento proces je prováděn separací specifických protilátek od ostatních antisérových proteinů a nespecifických imunoglobulinů afinitní chromatografií na pevné fázi.
Výhodou afinitně purifikovaných protilátek je zvýšení specifity, snížení nespecifické interakce na pozadí, zvýšení senzitivity a vyšší míra konzistence v rámci jednotlivých šarží. Je třeba však myslet na to, že během purifikačního procesů může dojít k eliminaci vysoce afinitních protilátek díky jejich afinitě k matrici. Z tohoto důvodu se pro detekci cílových proteinů o nízké koncentraci doporučuje spíše použití IgG frakce. Volba mezi IgG frakcí a purifikovanými protilátkami se odvíjí od našeho očekávání. Afinitně purifikované protilátky mají méně nespecifických interakcí, zatímco frakce IgG obsahují protilátky o vysoké afinitě. V obecném měřítku se dá říci, že IgG frakce jsou vhodné pro turbidimetrické stanovení, zatímco většina imunochemických metod by měla využívat protilátky afinitně purifikované.
6. Formát fragmentové protilátky – F(ab) nebo F(ab´)2
Formát používané sekundární protilátky se odvíjí od její samotné struktury. Běžné je použití kompletních IgG, ale ve speciálních případech je vhodné použít fragmenty protilátek. Fragmenty protilátek jsou vyráběny z kompletních IgG štěpením papainem v pantové oblasti. Touto cestou vznikají individuální regiony F(ab) (Obr.5.). Druhou variantou jsou fragmenty F(ab´)2. Ty vznikají též proteolytickým štěpením IgG, ale za použití pepsinu. V obou případech dochází k odstranění většiny Fc regionu.
Obr. 5.: Schématické znázornění struktury fragmentů protilátek po štěpení IgG prostřednictvím papainu a pepsinu.
Oba typy protilátek jsou menší než kompletní molekula IgG, tudíž umožňují lepší penetraci do tkáně a tak i lepší rozpoznání antigenu a zvyšují signál při IHC barvení. Druhou výhodou fragmentových protilátek je absence jejich Fc fragmentu. Díky absenci krystalizačního regionu je eliminována nespecifická vazba mezi Fc regiony protilátek a Fc receptory buněk. Proto jsou fragmentové protilátky oblíbené zejména při značení buněk s vysokým množstvím povrchových Fc receptorů – neboli při značení makrofágů, dendritických buněk, neutrofilů, NK buněk a B-lymfocytů a při detekci antigenů ve tkáních s vysokou hladinou endogenních Fc receptorů – slezina a brzlík.
F(ab) protilátky jsou dále využívány k blokování endogenní imunoglobulinů v buňkách a tkáních. Po klasickém blokování tkáně sérem v při metodě IHC se vzorek inkubuje s F(ab) fragmenty. Tím dojde k zablokování endogenních imunoglobulinů a je možné vyhnout se zvýšenému pozadí, ke kterému by docházelo v případě vazby klasických sekundárních protilátek na endogenní imunoglobuliny.
Navíc F(ab) mohou představovat mocný nástroj při několikanásobného barvení s použitím primárních protilátek stejného druhu. Vzhledem k tomu, že F(ab) fragmentové sekundární protilátky obsahují jen jedno vazebné místo pro antigen (jsou monovalentní), nemohou vázat žádnou další molekulu v případě postupného barvení (Obr. 6). F(ab´)2 sekundární protilátky nejsou pro tento účel vhodné kvůli 2 vazebným místům. Mohly by vázat v postupném barvení druhou sekundární protilátku a vykazovat tak falešně pozitivní výsledky.
Obr.6.: Dvojité barvení s využitím F(ab) fragmentové sekundární protilátky. V prvním kroku (vlevo) inkubace vzorku s první primární protilátkou. V 2. kroku (uprostřed) inkubace s F(ab) sekundární protilátkou konjugovanou s fluoforem např. s AlexaFluor 488. Následuje promytí. Ve 3. kroku (vpravo) inkubace vzorku s druhou primární protilátkou. Ve 4. kroku (též vpravo) inkubace s druhou sekundární protilátkou konjugovanou s dalším fluoforem např. AlexaFluor 647.3
Shrnutí
Jaké věci je třeba mít na paměti pří výběru sekundární protilátky? Zde je souhrn otázek, které byste si měli klást při výběru sekundární protilátky.
1. V jakém zvířecím organismu byla vyrobena vaše primární protilátka?
2. Jaká konjugovaná detekční molekula se hodí pro vaši aplikaci?
3. Používáte metodu enzymatické detekce? Preferujete HRP nebo AP?
4. Používáte metodu fluorescenční detekce? Podívejte se na rozsah emisních spekter, zvláště pokud děláte několikanásobné barvení.
5. Budete využívat techniku biotinu?
6. Jaká je třída/podtyp nebo podtřída vaší primární protilátky?
7. Potřebujete afinitně purifikovanou protilátkou nebo IgG frakci?
8. Potřebujete pro své účely preabsorbovanou sekundární protilátku?
9. Potřebujete ke svému experimentu F(ab) nebo F(ab´)2 fragmentovou protilátku?
Pokud nechcete ztrácet čas výběrem vhodné protilátky, ozvěte se nám, s výběrem vám rádi pomůžeme.
|
V oblasti sekundárních protilátek rádi spolupracujeme s: |
|
| RayBiotech | Cosmobio |
| Vector Laboratories | Nordic Biosite |
| Cloud-Clone | MyBiosource |
| Bethyl Laboratories | Biovision |
Pro přehlednost v používané nomenklatuře připojujeme i krátký výkladový slovníček.
| Goat | F(ab) | anti-Rabbit | IgG | (H+L) | Secondary Antibody | [PE] |
| Host species | Format | Species Reactivity | Target Ig | Specifity | Label |
Host Species: Zvířecí organismus, ve kterém byla protilátka připravena.
Format: Struktura sekundární protilátky.
Species Reactivity: Organismus, který je sekundární protilátkou rozpoznáván.
Target Immunoglobulin: Třída nebo podtřída imunoglobulinu, kterou chceme detekovat prostřednictvím sekundární protilátky.
Specificity: Region cílového imunoglobulinu, který sekundární protilátka rozpoznává.
Detection Label: Konjugovaná molekula, která je připojena k sekundární protilátce.
Seznam zkratek:
WB – Western blot, imunoblot
IHC – Imunohistochemie
IF – Imunofluorescence
ICC – Imunocytochemie
FACS – Fluorescence-activated cell sorting, průtoková cytometrie
ELISA – Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
FITC – Fluorescein-5-isothiokyanát
TRITC – Tetramethylrhodamin
Seznam použitých zdrojů:
1. Abcam: Understanding secondary antibodies.
2. ImmunoReagents Inc.: How to Choose the Best Secondary Antibody
3. Novus Biologicals: Secondary Antibody Handbook
4. Proteintech: How to choose the best secondary antibody for your application
5. Rockland: Tips for Selecting the Best Secondary Antibody
6. Sigma-Aldrich in now Merck: How to Choose a Secondary Antibody
7. Tebu-bio: Tips to select the best secondary
8. ThermoFisher Scientific: How to Choose and Aelect a Secondary Antibody