Speciální barvení

Krok 64: Vědět, co chceme vidět

Je třeba znát dobře metody speciálního barvení a vědět, co nám které barvení přinese a které struktury budou znázorněny.

 

„Jen následujeme protokol a nevíme, jaký výsledek barvení bude mít.“

Obr. A) Řez jater barvený na PAS. Lipofuscin a glykogen jsou PAS pozitivní, zatímco zbytky žluči a hemosiderinu jsou PAS negativní a lze pozorovat jejich přirozenou barvu (žlutou a hnědou). B) Průkaz Aspergilové infekce plic metodou Grocott-Gomori. Vlákna této houby (hyfy) jsou obarveny černě. U kuřáků a obyvatel měst jsou zároveň v plicích přítomna černá rezidua uhlíku.

 

Krok 65: Používat pozitivní kontrolu

Vždy používat kontrolní řez, o kterém víme, že obsahuje tkáňovou strukturu, kterou se snažíme prokázat.

 

„Pokud struktura tkáně, kterou hledáme, není po barvení vidět, předpokládáme, že ve vzorku není přítomna.“

 

Obr: Řez jater postižených cirhózou, barvených metodou Perl’s pro demonstraci železa (modré) v hemosiderinu. Blok je používán jako kontrola reakce na železo.

 

Krok 66: Dodržovat časy barvení

Dodržovat časy barvení v jednotlivých lázních.

Časy inkubací jsou pouze přibližné, což vede k nekonzistentním výsledkům

 

Obr: Dva řezy kůže ze stejného bloku (PAS). Řez A byl správně oxidován v kyselině jodisté po dobu 5 minut. Řez B omylem jen 30 sekund. Výsledkem je slabé zbarvení bazální membrány.

 

Krok 67: Kontrolovat stabilitu barvících roztoků

Zatímco některé barvící roztoky se časem příliš nemění, jiné je třeba připravovat těsně před použitím. Výjimkou nejsou ani takové roztoky, které musí nejprve oxidovat (dozrát) a teprve poté mohou být použity.

Předpokládáme, že všechny roztoky mají téměř neomezenou životnost.

 

Obr: Špatná kvalita Weigertova hematoxylinu způsobená oxidací – dlouhým skladováním. Všimněte si hnědého zabarvení kolagenu.

 

Krok 68: Správně skladovat barvící roztoky

Roztoky je třeba správně skladovat. Některé potřebují chlad, protože jsou náchylné k plesnivění nebo jsou citlivé na světlo a je nutno je skladovat ve tmě.

„Všechny naše barvící roztoky jsou uloženy na poličce nad barvícím stolem. Někdy vidíme v našich řezech zvláštní struktury plné mikroorganizmů „

Obr: Řez s patrnými usazeninami mikroorganismů, které vyrostly v barvícím roztoku (v tomto případě hematoxylinu), a po obarvení se uchytily na povrchu řezu.

 

Krok 69: Přesně dodržovat protokol barvení

Přesné dodržování protokolu barvení.

 

Laboranti občas dosahují rozdílných výsledků, i když údajně používají týž protokol.

Obr: Tyto řezy střevní submukózy fixované formalinem byly obarveny Massonovým trichromem. V řezu A vidíme správně obarvený hladký sval červenorůžově. Barvení bylo provedeno správně podle protokolu. Pokud je jeden krok vynechán, jako na řezu B, hladký sval se neobarví.

 

Krok 70: Zaznamenávat všechny změny

Vždy je třeba si zaznamenávat výstup z metod, které ten den byly použity.

 

Pokud nejsou výstupy zaznamenány, je obtížné hledat řešení, když nejsou výsledky optimální a záznamy o změnách protokolu chybí.

Obr: Řez ledviny v impregnačním barvení na retikulin (Gordon & Sweets). Retikulární vlákna jsou špatně impregnovaná stříbrem a na skle je v pozadí vidět precipitát. Je velmi obtížné určit příčinu podobných problémů, pokud není dodržen přesný protokol metody.

 

Krok 71: Standardizovat promývací kroky

Promývání by mělo být standardizované, aby se zabránilo variabilitě výsledků barvení.

 

Různí laboranti promývají různě. Někteří řezy propírají jemně, jiní silně třesou kyvetou, což má různý vliv na výsledek.

 

Obr: Dva stejné řezy jater (Gordon & Sweets). V řezu A bylo barvení provedeno podle protokolu. Řez B nebyl dostatečně promýván mezi impregnačním a redukčním krokem.

 

Krok 72: Pečlivě nastavit mikroskop

V klíčových krocích barvení používáme mikroskop. Při pozorování nezakrytých (vlhkých) řezů je však nutno dbát na jeho řádné nastavení, jinak bychom mohli docílit falešně pozitivních výsledků.

Úroveň barvení je vždy posuzována pouhým okem.

Obr. A) Mokrý řez (bez krycího skla) zobrazený pod mikroskopem s uzavřenou kondenzorovou clonou. Všimněte si falešného pozadí. B) Mokrý řez (bez krycího skla), zobrazený pod mikroskopem s otevřenou kondenzovanou clonou.

 

Máte další otázky?
Ozvěte se nám.
Mgr. Zuzana Manhartová

Mgr. Zuzana Manhartová

+420 735 177 202
zmanhartova@baria.cz