Pro své experimenty obnášející barvení chcete mít co nejlepší preparáty. Vynaložíte spoustu práce na to, aby byl váš vzorek po odběru, krájení a barvení uchován za správných podmínek. Poté, co dokončíte barvení a preparáty jsou konečně připraveny na prozkoumání a snímkování pod mikroskopem nebo na uložení na pozdější dobu, je důležité, aby vzorky tkání zůstaly chráněny. V této fázi procesu přichází na řadu krycí sklíčko.
I když je překrytí krycím sklíčkem v procesu barvení tím posledním krokem, jeho význam rozhodně nelze podceňovat. Správné překrytí zajistí, že vzorky tkání zůstanou chráněny pro optimální zobrazování a prohlížení.
V tomto příspěvku vás seznámíme s tím, jak správně použít krycí sklíčko, abyste své vzorky ochránili. Nezapomeňte se také podívat na video na konci příspěvku, kde se dozvíte, jak krycí sklíčka přiložit.
Před překrytím krycím sklíčkem uchovávejte podložní sklíčka v pufru
Po ukončení procesu barvení protokol obvykle vyžaduje, abyste preparát na podložním sklíčku promyli řadou čisticích činidel, například xylenem. Pokud se nechystáte podložní sklíčko ihned překrýt, měli byste je ponechat v roztoku. Zabráníte tak vysychání preparátu a vyblednutí zabarvení, o které jste se tak usilovně snažili.
U některých protokolů IHC, například H&E, je ponechání podložních sklíček s preparátem v roztoku několik hodin po barvení v pořádku. Pokud postupujete podle protokolu IF, měli byste se snažit o co nejrychlejší zakrytí, abyste zachovali fluorescenční signál.
Odstraňte přebytečný pufr
Jakmile jste připraveni aplikovat krycí sklíčko, je třeba odstranit přebytečné čisticí činidlo. To lze provést vyjmutím podložního sklíčka z roztoku a jemným oklepáním sklíčka ve svislé poloze o savý materiál, jako je například Kimwipes™, papírová utěrka apod. Stejný absorpční materiál můžete použít také k odstranění přebytečného materiálu ze zadní strany sklíčka, aby se se sklíčkem lépe manipulovalo.
Zakápněte vzorek tkáně montovacím médiem
Po odstranění přebytečného čisticího činidla byste měli na sklíčku hned vzorek fixovat pomocí vhodného montovacího média. Při přidávání média dbejte zvýšené opatrnosti, aby se na sklíčku nevytvořily vzduchové bubliny. Zabráníte tak rušivým bublinám na snímcích při pozdějším fotografování. Dbejte také na množství používaného montovacího média. Použijte dostatečné množství montovacího média, jak je zapotřebí k pokrytí vzorku, ale vyvarujte se použití přílišného množství, protože v takovém případě by se přebytečné médium vytlačilo mimo krycí sklíčko.
Jemně přiložte krycí sklíčko
Při pokládání krycího sklíčka je důležité postupovat co nejjemněji. Při použití příliš velké síly může dojít k roztržení vzorku a vzniku artefaktů na sklíčku. Přidržte horní a spodní hranu podložního sklíčka mezi palcem a ukazováčkem jedné ruky a jemně krycí sklíčko přiložte. Sklíčko můžete uchopit vertikálně nebo horizontálně. Druhou rukou přiložte spodní hranu krycího sklíčka k podložnímu sklíčku tak, aby krycí sklíčko s podložním sklíčkem svíralo úhel 45 stupňů. Pomalu a jemně přiklopte krycí sklíčko na podložní sklíčko tak, aby překrylo vzorek.
Při použití této techniky se nejen vyvarujete poškození tkáně, ale také zabráníte zachycení vzduchových bublin pod krycím sklíčkem. Pokud jsou přítomny vzduchové bubliny, můžete na krycí sklíčko jemně zatlačit, abyste je vytlačili, ale dbejte na to, abyste netlačili příliš silně nebo přímo na vzorek, protože to by mohlo způsobit poškození tkáně.
Volitelný krok: V závislosti na použitém montovacím médiu může být nutné krycí sklíčko připevnit. Pokud použijete montovací médium jako například VECTASHIELD® Antifade Mounting Media, není nutné krycí sklíčko připevňovat.
Své preparáty můžete v několika rychlých krocích překrýt, a mít tak jistotu, že vzorky budou uchovány pro veškeré další experimenty. Další tipy a triky pro své preparáty najdete v průvodci přípravou barvených vzorků (Staining Sample Prep Guide) od Vector Laboratories a v dalších příspěvcích na jejich blogu.
Prohlédněte si video na konci originálního článku, které ukazuje, jak správně překrýt podložní sklíčko s preparátem krycím sklíčkem a získat vysoce kvalitní vzorek k mikroskopování.
(Převzato od společnosti Vector Laboratories, redakčně upraveno.)