Úvod
Součástí imunotestů na pevné fázi, jako je ELISA, je imobilizace biomolekul, zejména proteinů, na povrch, pomocí pasivních nebo kovalentních interakcí. Schopnost povrchu interagovat s proteiny a jinými biomolekulami je samozřejmě zásadní vlastnost; nespecifická vazba (NSB) jiných proteinů nebo biomolekul na neobsazená místa na povrchu během následujících kroků testu však může snižovat specificitu a citlivost výsledků metody.
Nespecifickou vazbu na povrch lze minimalizovat nasycením těchto neobsazených vazebných míst blokovacím činidlem – souhrnný název pro různé látky, které se používají ke snížení počtu NSB, aniž by se aktivně podílely na specifických reakcích testu. (NSB mohou být ovlivněny i dalšími faktory, jako jsou interakce protein-protein, které jsou pro každý ELISA systém jedinečné, a je nutné je brát v úvahu při vývoji a optimalizaci testu.) Blokovací činidla a metody se obvykle volí empiricky, vzhledem k tomu, že nebyl stanoven standardizovaný postup, vhodný pro všechny aplikace. Pro jakoukoliv aplikaci nebo test lze obvykle snadno zvolit nejlepší metodu výběrem blokovacího činidla v závislosti na:
• Typu povrchu
• Typu biomolekuly imobilizované na povrchu
• Použitého typu detekční sondy / systému
Dvě hlavní kategorie blokujících činidel jsou:
• Proteiny
• Detergenty (obvykle neionogenní)
Výhody a nevýhody obou kategorií budou popsány v tomto článku a srovnány s vlastnostmi ideálního blokačního činidla (univerzální blokující činidlo pro všechny testy je idealistické, nereálné).
Ideální blokovací činidlo by mělo:
• Inhibovat nespecifickou vazbu (pasivní a kovalentní) složek testu na povrch
• Inhibovat nespecifické protein-protein interakce
• Nereagovat křížově s následujícími složkami testu (tj. protilátky, protein A)
• Působit jako stabilizátor (nebo pomáhat při renaturaci) biomolekul minimalizováním účinků denaturace, které jsou způsobeny změnou fáze při testech na pevné fázi
• Vykazovat nízkou aktivitu enzymu (nebo jinou aktivitu, která může interferovat s detekční metodou)
• Nerušit vazby, které imobilizují specifický protein nebo biomolekulu na povrch
• Mít konzistentní a reprodukovatelné výsledky v každé šarži
Blokování povrchu za účelem snížení nespecifické vazby je kompromisem mezi nízkým pozadím a vysokou citlivostí a specificitou. Pro konkrétní test je pak vybrané blokovací činidlo a metoda optimalizována, ale nikoli ideální.
Typické problémy spojené s blokovacími činidly
Vzhledem k tomu, že neexistuje ideální univerzální blokovací činidlo pro všechny metody, je nutné zvážit výhody a nevýhody každého typu a posoudit, jak jejich vlastnosti ovlivní test. Příklady hlavních problémů spojených s blokovacími činidly jsou:
• Nekonzistence šarží (některé zdroje hovězího séra, albuminu, rybí želatiny a normálního savčího séra se liší kvalitou jednotlivých šarží)
• Maskování povrchově vázaných proteinů interferencí se specifickými protein-protein interakcemi (rybí želatina má sklony blokovat interakce typu protein-protein častěji než povrch-protein, čímž snižuje více specifických než nespecifických vazeb)
• Nedostatečná molekulární různorodost (jedno-molekulární blokovací činidla často nejsou dost komplexní, aby blokovala povrchy obsahující hydrofobní, iontové a kovalentní oblasti)
• Křížové reakce se složkami testu (tj. Protein A bude křížově reagovat s nespecifickými molekulami IgG normálního savčího séra)
• Narušení nekovalentních vazeb mezi specifickými biomolekulami a povrchem (tj. neiontové detergenty mohou vytěsňovat hydrofobně vázané proteiny a biomolekuly)
• Interference s detekcí v důsledku aktivity endogenních enzymů, vlastní fluorescence atd.
Detergentová blokovací činidla
Jednou z hlavních kategorií blokovacích činidel jsou detergenty – ionogenní a neionogenní. Pro imunotesty na pevné fázi na polystyrenu (nebo jiném tvrdém plastu) se ionogenní detergenty jako jediné blokovací činidlo téměř nepoužívají, a to kvůli:
• Jejich sklonu narušovat iontové a hydrofobní povrchové vazby biomolekul
• Jejich schopnosti rozpouštět proteiny
• Jejich tendenci inhibovat (nebo ukončit) reakce enzym-substrát
Zwitteriontové detergenty jsou jednoduše špatné blokátory, tudíž ani nejsou považovány za blokovací činidla. Detergenty používané jako blokovací činidla jsou obvykle neionogenní (nejběžnější z nich je TWEEN® 20) a jsou považovány za dočasné blokátory; nevytvářejí trvalou bariéru proti navázání biomolekul na povrch, protože jejich blokovací schopnost se ruší promytím vodou nebo vodným pufrem. Aby byl detergent použitelný jako jediné blokovací činidlo v imunotestu, musí být přítomen i ve všech pufrech následujících po potažení povrchu vazebnou molekulou. Pokud se ale použijí dohromady s proteinovým blokátorem, zvyšují detergenty příhodně a levně blokovací schopnost během promývacích kroků, atd., blokováním těch oblastí povrchu, které mohou být odhaleny v důsledku desorpce proteinu / biomolekuly.
Neionogenní detergenty jsou výhodné z následujících důvodů:
• Jsou levné, i když musí být použity ve stejné nebo vyšší koncentraci, než je hodnota jejich Kritické Micelární Koncentrace (CMC) (typické koncentrace pro TWEEN 20 jsou 0,01% až 0,10%)
• Jsou extrémně stabilní a lze je skladovat ve zředěné formě (tj. promývací pufry) při pokojové teplotě po delší dobu, aniž by došlo ke ztrátě blokovací aktivity
• Jsou užitečné v promývacích pufrech, protože jejich přítomnost blokuje oblasti na povrchu, ze kterých se během promývání můžou uvolnit specificky vázané biomolekuly, a také pomáhá uvolnit volně vázané biomolekuly, které jsou fyzicky zachyceny v rozích
Hlavní nevýhody spojené s neionogenními detergenty:
• Mohou narušovat nekovalentní vazby biomolekula-povrch
• Blokují pouze hydrofobní interakce
• Detergent, který zůstane v jamkách po imobilizaci konjugátu peroxidázy může interferovat s jeho enzymatickou aktivitou.
• Nejsou to trvalé blokátory
• Nelze je použít s lipopolysacharidy kvůli jejich schopnosti vzájemně kompetovat o místa na povrchu
Pro použití neionogenního detergentu jako blokovacího činidla v imunotestech na tvrdém plastiku (tj. 96 jamkové mikrodestičky nebo stripy) jej doporučujeme přidat do promývacího pufru a nepoužívat jej jako jediné blokující činidlo v imunotestu. TWEEN 20 je nejběžněji používaný v koncentracích od 0,01% do 0,1%. Některé neionogenní detergenty, například Triton ™ X-100, přestože jsou vynikající blokátory nespecifické vazby na povrch, mohou způsobit vysokou ztrátu specifické vazby, což má za následek falešně negativní výsledek. Používáním neionogenních detergentů v nízkých koncentracích v promývacích pufrech, lze eliminovat negativní aspekty a zároveň využívat jejich přidané schopnosti blokování.
Proteinové blokátory
Proteinové blokátory slouží dvěma účelům:
• Blokují neobsazená místa na povrchu
• Oddalují a stabilizují biomolekuly navázané na povrch, a tím zmenší problémy se stérickým bráněním a problémy s denaturací spojené s imunotesty na pevné fázi
Na rozdíl od neionogenních detergentů jsou bílkoviny permanentními blokátory a stačí je přidat pouze jednou po potažení povrchu vazebnou molekulou. Je však běžnou praxí přidat proteinové blokátory k rozpouštědlům použitým pro následné reaktanty imunotestu, a tím dále snížit pozadí a stabilizovat povrchově vázané biomolekuly. Mezi nejčastěji používané proteinové blokátory patří:
• Hovězí sérový albumin
• Odtučněné sušené mléko nebo kasein
• Kompletní normální sérum
• Rybí želatina
Každý z těchto blokátorů má své vlastní výhody a nevýhody.
Hovězí sérový albumin
Hovězí sérový albumin (Bovine serum albumin, BSA) se obvykle používá v koncentraci 1% až 3%. BSA je levný a může být skladován sušený nebo jako sterilní roztok při 4°C. Použití BSA jako blokovacího činidla je dobře zdokumentováno a bylo prokázáno, že je dobrým blokátorem nespecifických vazeb protein-povrch na středně a vysoce vazebných, a často i na předem aktivovaných kovalentních površích. Výhoda používání BSA je jeho kompatibilita s proteinem A.
Nevýhody BSA zahrnují:
• Variabilita šarží – primárně souvisí s obsahem mastných kyselin (BSA použitý jako blokovací činidlo by neměl obsahovat mastné kyseliny)
• Přítomnost fosfotyrosinu v přípravcích frakce V, který křížově reaguje s anti-fosfotyrosinovými protilátkami
• Křížové reakce s protilátkami připravenými proti konjugátu BSA-hapten (BSA je typicky vázán s malými hapteny, které nemají samostatně schopnost vyvolat imunitní odpověď)
• Nedostatečná rozmanitost, nutná k zablokování některých kovalentních povrchů, které mají hydrofobní, iontové a kovalentní vlastnosti
Přes své nevýhody je BSA pravděpodobně nejpoužívanější blokovací činidlo pro imunotesty na pevné fázi.
Odtučněné sušené mléko
Odtučněné sušené mléko (Non-fat dry milk, NFDM) se obvykle používá v koncentracích 0,1% až 0,5% a je relativně levné; nicméně přípravky z něj se liší v kvalitě. Našli jsme pouze jeden zdroj NFDM (2% roztok), který vykazuje přijatelnou konzistenci a stabilitu napříč jednotlivými šaržemi. NFDM, ať už domácí nebo komerční, má tendenci rychle se kazit, pokud není správně připraveno a skladováno. I přesto může být kasein, složka odtučněného sušeného mléka, používán jako stabilní blokovací činidlo (primárně pro DNA bloty). NFDM má ve vodných pufrech větší rozpustnost než čistý kasein, což může být důvod, proč je lepším blokátorem na površích tvrdých plastů. Přestože je NFDM kompatibilní s proteinem A a projevuje nízkou křížovou reaktivitu s typickými složkami imunotestu, vykazuje tyto problematické vlastnosti:
• Mléko obsahuje fosfotyrosin, který reaguje s anti-fosfotyrosinovými protilátkami
• Některé přípravky NFDM mohou obsahovat histony, které mohou interferovat s detekčními technikami mířenými proti DNA
• Některé přípravky NFDM mohou inhibovat aktivitu alkalické fosfatázy
Celkově se jedná o drobné problémy. NFDM je vynikající blokovací činidlo a díky své molekulární rozmanitosti a amfipatickým vlastnostem je preferovaným blokovacím činidlem pro mnoho kovalentních povrchů.
Rybí želatina
Přestože je rybí želatina poměrně oblíbená jako blokovací činidlo, má některé zásadní nevýhody. Želatina obvykle není dostatečný blokátor, pokud se používá samostatně, a je dokonce nejméně účinný blokátor diskutovaný v tomto článku pro biomolekula-povrch. Blokuje hlavně interakce protein-protein, někdy maskuje specifické povrchově vázané proteiny a ovlivňuje imunoreaktivitu. Nižší schopnost blokování povrchu a vlastnost maskování proteinů vede k vyššímu pozadí a snížené citlivosti. Želatina má také tendenci kolísat v kvalitě napříč šaržemi. Největší výhoda rybí želatiny je nízká křížová reaktivita se savčími protilátkami a proteinem A.
Kompletní sérum
U extrémních problémů s blokováním se doporučuje použít kompletní normální sérum v 10% koncentraci. Díky jejich molekulární rozmanitosti, kompletní séra účinně blokují nespecifické:
• Interakce biomolekula – povrch (pasivní adsorpce)
• Kovalentní interakce biomolekula – povrch
• Interakce protein-protein, kde navíc působí jako stabilizátor proteinů
Nevýhodou použití kompletních normal sér jako blokovacího činidla je křížová reaktivita s proteiny A a anti-IgG protilátkami. Vzhledem k tomu, že imunotesty jsou často založeny na systému, který využívá značenou sekundární anti-IgG protilátku (enzymem, radioaktivní značkou, atd.), blokování kompletním normal sérem může kvůli křížové reaktivitě vést k falešně pozitivním reakcím a častým nespecifickým vazbám. Alternativy k savčím normal sérům jsou rybí nebo kuřecí séra. Tyto druhy nevykazují problémy s křížovou reaktivitou jako u jejich savčích ekvivalentů, přesto si zachovávají pozitivní aspekty molekulární rozmanitosti za účelem blokování povrchů se smíšenými vlastnostmi (hydrofobní, hydrofilní a kovalentní funkční skupiny).
Smíšené blokátory
Se zvyšující se citlivostí a různorodostí povrchů imunotestů vyvstává i potřeba dalších blokovacích činidel, která budou vykazovat celou řadu funkcí nad rámec redukce nespecifických pozadí. Příklady alternativních blokátorů zahrnují polymery jako je polyethylenglykol (PEG), polyvinylalkohol (PVA) a polyvinylpyrrolidon (PVP). Tato blokující činidla jsou známá pro jejich schopnost pokrýt hydrofobní povrchy a učinit z nich tak nevazebné i hydrofilní. Tato schopnost vytvořit hydrofilitu byla využita pro jednokrokové imunotesty na matricích s laterálním tokem (tj. těhotenské testy dostupné bez předpisu).
Přiřazení blokačního činidla k jednotlivým povrchům
Pasivní povrchy
Hydrofobní povrchy jsou obvykle značeny jako středně vazebné. Tyto povrchy lze účinně blokovat buď neionogenními detergenty nebo proteinovými blokátory. Podle našich zkušeností se použití kombinace 0,02% TWEEN® 20 a 1% BSA ukazuje jako ideální pro většinu testů na středně vazebných površích.
Povrchy, složené z hydrofobních a iontově vazebných míst se obvykle nazývají vysoce vazebné. Díky schopnosti IgG a jejich konjugátů vytěsňovat detergenty, blokují se vysoce vazebné povrchy obtížněji než povrchy středně vazebné. Pro účinnou minimalizaci nespecifických vazeb se doporučuje kombinované použití neionogenního detergentu (0,02% TWEEN 20) a proteinové blokátory (1% BSA, 0,2% NFDM, 10% normálních sér atd.). Výběr proteinových blokátorů pak závisí více na reaktivních biomolekulách imunotestu než na povrchu samotném.
Povrchy, které jsou vysoce nabité a nevykazují téměř žádné hydrofobní vlastnosti, musí být blokovány proteinovým blokátorem. Jelikož se iontový povrch obvykle používá pouze k imobilizaci malých iontových molekul, musí být zvolený blokátor relativně malý, aby se zabránilo zakrytí specifické vazebné molekuly, a zároveň musí vykazovat vhodné ionty, aby mohl interagovat s povrchovým nábojem. BSA (1% až 3%) nebo odtučněné sušené mléko (0,2% až 2%) lze použít pro většinu imunotestů, ale menší molekula, jako například ethanolamin (10%), může být pro specifickou vazbu velmi malých biomolekul nezbytná. Neiontové detergenty jsou pro blokování iontového povrchu nepoužitelné.
Kovalentní povrchy
Pro aminové povrchy, používané u bifunkčních zesíťovacích prostředků, musí být použity proteinové blokátory, schopné interakce s nezreagovanými hydrofobními místy, iontovými místy a kovalentními místy. Pokud je to možné, doporučujeme použít odtučněné sušené mléko (0,2% až 2%). Další možností je použít 10% normal sérum jako primární blokovací činidlo nebo jako složku pufrů použitých po potažení. Pro tento povrch jsou neionogenní detergenty jako blokátory neúčinné, ale přidáním TWEEN 20 do promývacího pufru může zefektivnit odstraňování nenavázaných, mechanicky zachycených biomolekul.
Preaktivované kovalentní povrchy (N-oxysukcinimid, Maleimid, Hydrazid, Universal) se téměř vždy skládají z hydrofobních a kovalentních oblastí. Amfipatické proteiny bývají nejvíce účinné blokátory kovalentních povrchů. Neionogenní detergenty neblokují kovalentní interakce, ale jejich přítomnost v promývacích pufrech se doporučuje bez ohledu na použitý povrch. Následuje doporučená metoda pro blokování čtyř výše uvedených aktivovaných kovalentních povrchů:
Pro kovalentní imobilizaci konkrétní biomolekuly na povrch, zablokujte destičku přibližně 2% BSA po dobu asi 30 minut. Rozpouštědlo pro BSA by mělo být kompatibilní s povrchem a hodnota pH upravena tak, aby umožňovala kovalentní interakci mezi blokátorem a povrchem. Pokud je použit jiný proteinový blokátor než BSA, musí mít odpovídající funkční skupinu, která je schopna interakce s kovalentními místy na povrchu.
S ohledem na komplexitu chemického složení povrchů se důrazně doporučuje přidávat 10% normal séra (jako je fetální hovězí, kozí, rybí nebo kuřecí sérum) ke všem diluentům reagencií pro většinu testů. Normal séra mají molekulární rozmanitost potřebnou pro blokování nespecifických vazeb díky hydrofobním, iontovým a kovalentním interakcím.
Závěr
Výběr vhodného blokovacího systému je zásadní pro vývoj specifického a citlivého testu. Nejčastěji se vybírá na základě vhodnosti, literatury a toho, „co již v minulosti fungovalo.“ Ve skutečnosti je ale pro výběr nejlepších blokátorů a optimalizace postupu blokování nutné empirické testování. Testování je pak silně ovlivněno chemickým složením povrchů a interakcemi specifickými pro konkrétní reaktanty, především křížovou reaktivitou. Blokovací činidlo může díky zkřížené reaktivitě zcela inhibovat nespecifické interakce s povrchem a nesnižovat poměr signálu k šumu.
Během vývoje postupu blokování se doporučuje, aby byl každý z navrhovaných blokátorů a podmínek blokování (pufry, inkubační časy atd.) vyhodnocen na křížovou reaktivitu se všemi ostatními reaktanty testu. Ideální blokátor a blokovací postup bude účinně a reprodukovatelně eliminovat nespecifické povrchové vazby a zlepšovat citlivost a specificitu testu – což má za následek stanovení vysokého signálu / nízkého šumu.
Aspekty jednotlivých uspořádání u metody ELISA jsme detailně popsali v jednom z našich dřívějších článků.
V případě, že vaše ELISA metoda nevychází tak, jak by měla, přečtěte si tento článek.
Reference
• Bjerrum OJ and Heegaard NHH. Handbook of Immunoblotting of Proteins, Volume 1. Boca Raton, Florida: CRC Press, Inc., 1988.
• Craig JC, et al. Journal of Biological Standardization. 1989; 17:125-135.
• Engvall E and Perlmann P. Immunochemistry. 1971; 8:871.
• Gardas A and Lewartowska A. Journal of Immunological Methods. 1988; 106:251-255.
• Graves HCB. Journal of Immunological Methods. 1988; 111:157-166.
• Kenny GE and Dunsmoor CL. Israel Journal of Medical Sciences. 1987; 23:732-734.
• Maggio ET. Enzyme Immunoassay. Boca Raton, Florida: CRC Press, Inc.; 1980.
• Stenberg M and Nygren H. Journal of Immunological Methods. 1988; 113:3-15.
• Vogt RF, et al. Journal of Immunological Methods. 1987; 101:43-50
(Převzato od společnosti Corning, redakčně upraveno.)