Autor: Martin Wilson, PhD
Imerzní objektivy: Použití oleje, glycerolu nebo vody pro překonání určitých mezí rozlišení
Při zkoumání vzorků při vysokém zvětšení pomocí mikroskopu je třeba vzít v úvahu řadu faktorů. Patří mezi ně rozlišení, numerická apertura (NA), pracovní vzdálenost objektivů a index lomu média, kterým je obraz shromažďován čočkou objektivu.
V tomto článku se stručně podíváme na to, jak použití média mezi krycím sklíčkem a přední čočkou objektivu pomáhá zvýšit NA a rozlišení. Kromě toho vezmeme v úvahu index lomu vzduchu a skla, ze kterého se skládají diapozitivy a krycí sklíčka. Dále se budeme zabývat použitím média ohledně snížení chybovosti ve chvíli, kdy světlo prostupuje z jednoho média do druhého. Nakonec článek obsahuje i praktické tipy pro použití olejových imerzních systémů a výhody použití vodních imerzních objektivů, zejména při zobrazování živých buněk.
Imerzní kapaliny
Jedním z hlavních problémů ve světelné mikroskopii je překonat některé limity optického rozlišení a zvýšit NA systému. Stručně řečeno, NA objektu je schopnost sbírat světlo ze vzorku, zatímco rozlišení je schopnost objektu rozlišovat detaily ve vzorku.
Rozlišením a NA se však budeme zabývat v jiných článcích. Nyní prozkoumáme techniky imerze dostupné pro mikroskopy, které umožňují zobrazování vzorků při velkém zvětšení, a zároveň překonávají některé limity rozlišení.
Ponořením objektivu do kapaliny na místo vzduchové mezery mezi čočkou objektivu a krycím sklem vzorku zvyšujeme rozlišení objektivu. Když světlo prochází z jednoho média do druhého (například skrz sklo do vzduchu), láme se – jinými slovy, ohýbá se a rozptyluje. Žádné světelné paprsky, které se lámou do vzduchu, odrážejí se od krycího skla nebo jsou blokovány kovovým pouzdrem přední čočky objektivu, nepřispívají k tvorbě kvalitního obrazu. Účelem imerzní kapaliny je snížit množství lomeného světla, odrazu světla od vzorku a zvýšit schopnost objektivu zachytit toto jinak rozptýlené světlo (viz obrázek 1).
Obrázek 1:
Vlevo: Když světlo prochází dvěma médii s různými indexy lomu (například skrz sklo do vzduchu), láme se. Světelné paprsky, které se lámou skrz vzduch, odrážejí se od krycího skla nebo jsou blokovány kovovým pouzdrem čočky objektivu, nepřispívají ke kvalitní tvorbě obrazu.
Vpravo: Místo vzduchu je použita imerzní kapalina s indexem lomu přizpůsobeným indexu lomu krycího skla a média, na které je vzorek namontován, a snižuje tak míru lomu a odrazu světla od vzorku.
Index lomu
Fyzikální vlastnosti vzorku, kterým prochází světelné paprsky, určují „index lomu.“ Index lomu je číselná hodnota (bez jednotek), která určuje, do jaké míry se bude světlo lámat při průchodu materiálem. Vzduch má index lomu 1,0, zatímco podložní sklíčka a krycí skla mikroskopů mají obvykle index lomu 1,5. Vezmeme-li v úvahu tento rozdíl, účelem imerzní kapaliny je co nejpřesněji srovnat index lomu skla, ve kterém je vzorek namontován, čímž se zvýší množství světelných paprsků, které vytvoří konečný obraz. Proto má většina imerzních olejů index lomu 1,51. Běžné indexy lomu viz tabulka 1.
TABULKA 1:
Homogenní imerzní systém
Ideálním scénářem je vytvořit takzvaný „homogenní imerzní systém“. Pomocí tohoto systému je možné dosáhnout maximálního rozlišení a NA. Účelem homogenního imerzního systému je, co nejpřesněji srovnat index lomu a NA objektivu, imerzního média, krycího skla, montovacího média a čočky kondenzoru (viz obr. 2 a tabulka 1).
Přidání imerzní kapaliny na čočku kondenzoru není nutné. Pokud je mikroskop správně nastaven a vyrovnán tak, aby bylo dosaženo optimálního kontrastu a osvětlení napříč vzorkem (viz článek o Koehlerově osvětlení), bude poloha a nastavení kondenzoru optimalizována tak, aby přispěla k maximální NA systému mikroskopu.
Obrázek 2: Indexy lomu všech optických prvků mezi vzorkem a čočkou objektivu mají zásadní vliv na kvalitu obrazu. V ideálním případě by se měly navzájem co nejvíce shodovat, tedy jako v tomto příkladu vzorku namontovaného v montážním médiu na bázi glycerolu.
Pracovní vzdálenost
Jedním z dalších faktorů, které je třeba vzít v úvahu u objektivů mikroskopu, je „pracovní vzdálenost“. Jedná se jednoduše o skutečnou vzdálenost mezi přední čočkou objektivu a povrchem krycího skla, když je vzorek zaostřen (viz obr. 3).
Mezi pracovními vzdálenostmi a zvětšením každého objektivu existuje inverzní vztah. Například 10x objektiv může mít pracovní vzdálenost 4 mm, zatímco pracovní vzdálenost 100x olejového objektivu bude typicky v oblasti 130 mm. Pro srovnání, některé imerzní vodní objektivy nebo ponorné vodní objektivy nabízejí pracovní vzdálenosti kolem 3 mm. Pracovní vzdálenost je další informace, která je obvykle vyryta na hlavici objektivu a zkrácena jako „WD.“
Obrázek 3: Pracovní vzdálenost je vzdálenost mezi čočkou objektivu a povrchem krycího skla.
Olejové imerzní objektivy
Obrázek 4: Olejové imerzní objektivy jsou ideální pro vzorky, které jsou namontovány do média, které odpovídá indexu lomu skla.
Rozhodujícím faktorem, který si musíte pamatovat při použití objektivů s olejem, je použití správně sladěného imerzního oleje. Používejte pouze olej doporučený výrobcem objektivů. Po mnoho let se běžně používal olej z cedrového dřeva (ten je stále komerčně dostupný). Ačkoli má tento olej index lomu 1,516, má tendenci tvrdnout a může způsobit poškození čoček, pokud nebude po použití odstraněn. Kromě toho bude tento olej absorbovat modrou vlnovou délku, ultrafialové světlo a může také věkem žloutnout.
Většina moderních olejů je vyráběna synteticky a standardizována, aby se zajistilo, že nepoškodí čočky nebo nezmění s věkem barvu. Je třeba mít na paměti, že imerzní olej má optimální pracovní teplotu. Většina komerčních syntetických olejů je navržena pro práci při 23 ° C a změna pouze o 1 ° C bude mít za následek změnu indexu lomu 0,0004. K dispozici jsou i jiné oleje, které optimálně fungují při různých teplotách, ale pro většinu účelů by mikroskop měl být udržován ve stabilní teplotě 23 ° C.
Při použití olejových imerzních objektivů (viz obr. 4) pro fluorescenční mikroskopii se doporučuje použít speciální fluorescenční olej. Mnoho olejů může za určitých podmínek fluoreskovat. Většina olejů pro fluorescenční mikroskopii je označena písmenem „F“ před nebo za názvem oleje.
Použití olejových imerzních objektivů
• Začněte tím, že si prohlédnete svůj vzorek s objektivem s malým zvětšením a najdete na svém snímku oblast zájmu.
• Postupně postupujte až k objektivu 40x.
• Otočte objektiv mezi objektivem 40x a 100x, ale objektiv s největším zvětšením plně nezapojujte.
• Při pohledu ze strany mikroskopu opatrně naneste jednu kapku imerzního oleje přímo na krycí sklo. Vsuňte objektiv s největším zvětšením na místo, použijte hrubé a poté jemné zaostření, aby se čočka objektivu dostala do kontaktu s olejem. Některé olejové objektivy mají konkávní přední čočku, což znamená, že byste měli do objektivu přidat také kapku oleje, abyste zabránili zachycení vzduchových bublin v konkávní čočce.
• Poté se můžete znovu podívat do okulárů. K nastavení zorného pole používejte pouze jemné zaostření. Přestože objektivy s velkým zvětšením mají odpružený konec, hrubé zaostření v této fázi může snadno vést k prasknutí krycího skla nebo skluzu a může také poškodit čočku objektivu.
• I když poté plánujete zkoumat další vzorky, měli byste v této fázi vždy odstranit z objektivu olej, abyste zabránili možné kontaminaci ostatních částí mikroskopu. Imerzní olej může (a bude) pronikat a může tak poškodit součásti a objektivy mikroskopu, které nejsou vhodné pro ponoření do oleje. Přebytečný olej odstraňte čistícím ubrouskem na čočky jediným plynulým pohybem přes čočku. Pohyb opakujte, dokud nebude objektiv zcela čistý. K dispozici jsou komerční řešení pro odstraňování oleje nebo je možné použít malé množství xylenu pro konečné čištění čočky.
Vodní imerzní objektivy
Obrázek 5: Vodní imerzní objektiv je speciální druh objektivu s inertní špičkou a dlouhou pracovní vzdáleností.
Méně častým objektivem je tzv. imerzní vodní objektiv, který poznáte dle značení na objektivu písmenem „W“ nebo „WI“. Imerzní vodní objektiv se velmi doporučuje při zobrazování živých buněk, které jsou v buněčném médiu. Existují dva typy vodních imerzních objektivů (viz obr. 5) – „vodní imerzní (water immersion)“ a „vodní ponorné (water dipping)“ (obvykle zkráceno jako „WD“ na hlavici objektivu.
Tzv. „water dipping“ (ponorné objektivy) objektivy se běžně používají ve svislé konfiguraci mikroskopu a používají se k přímému ponoření do vody nebo vodného média / pufru. „Water dipping“ objektivy jsou vyráběny tak, aby poskytovaly velmi dlouhou pracovní vzdálenost. Vyrábí se z inertního materiálu, jako je keramika. Imerzní vodní objektivy (water immersion) se používají podobným způsobem jako olejové imerzní objektivy, ale místo kapky oleje se používá voda.
Jednou z výhod použití imerzního vodního objektivu je jednoduše to, že se jako médium používá voda. Je zřejmé, že se snadno nanáší a čistí. Navíc nemusíte používat specifický imerzní olej v závislosti na prováděném zobrazování.
Při použití vodního imerzního objektivu však existují určité nevýhody. Olejové imerzní objektivy dosahují vyššího rozlišení než vodní imerzní objektivy. Navíc díky viskozitě vody (ve srovnání s olejem) může být použití vodních imerzních objektivů náchylné na vibrace a malé pohyby vzduchu. Takové artefakty lze překonat zajištěním umístění mikroskopu na antivibrační stůl. Jednodušším řešením je také umístit speciální prstenec přes krycí sklo, který vytvoří kapku vody. Další nevýhodou vodních imerzních objektivů je jejich cena. Některé vodní imerzní objektivy mohou stát stejně jako kompletní mikroskop pro výzkumné účely.
Společnost Leica nabízí mikroobjemový dávkovač vody, který překonává potenciální problém s odpařováním vody během dlouhodobých experimentů se zobrazováním živých buněk nebo screeningovými experimenty (viz obr. 6).
Obrázek 6: Vodní imerzní dávkovač přidává imerzní tekutinu automaticky během pozorování.
Hlavní výhoda imerzních vodních objektivů přichází při zobrazování živých buněk a tkání. Je to způsobeno hlavně skutečností, že objektivy pro ponoření do oleje nejsou vhodné pro zobrazování buněčnými nebo tkáňovými komorami používanými pro mikroskopii živých buněk.
Zobrazování živých buněk
Živé buňky jsou obvykle obsaženy v komoře a jsou pokryty buněčným médiem (nebo pufrem). Komora a médium pomáhají zajistit, aby byly buňky nebo tkáň během zobrazování udržovány ve stabilním prostředí. V důsledku toho bude optimální ohnisková vzdálenost v relativně velké vzdálenosti od povrchu komory. Díky tomu je krátká pracovní vzdálenost imerzních olejových objektivů nevhodná pro zobrazování živých buněk přes krycí sklo, komoru a médium.
Navíc by použití imerzního olejového objektivu k prohlížení buněk ve vodném médiu způsobilo další problémy s lomem, protože olej a voda mají různé indexy lomu.
Korekční objímky
Navzdory lomu, který může nastat na rozhraní vody, skla nebo plastu, jsou vodní imerzní objektivy obvykle korigovány. Některé vodní imerzní objektivy mají navíc korekční objímky. Tyto kroužky kolem hlavně objektivu lze nastavit tak, aby vyhovovaly různé tloušťce krycích skel.
Leica také nabízí motorizované korekční límcové objektivy, které umožňují přesné nastavení objektivů, a které zajišťují obnovení optimálního rozlišení s minimálním narušování vzorků a nastavení zobrazení (viz obr. 7).
Obrázek 7: Korekční límec umožňuje přizpůsobení objektivu různým tloušťkám krycích skel. Motorizovaný korekční límec může obnovit optimální nastavení s minimem narušení.
Vodní imerzní objektivy a konfokální mikroskopie
A konečně, jednou z nejvhodnějších aplikací vodních imerzních objektivů je konfokální zobrazování živých buněk. Jako takové jsou obvykle jednou ze standardních funkcí mnoha konfokálních systémů. Vzhledem k nízké viskozitě vody ve srovnání s olejem má použití těchto objektivů za následek menší povrchové napětí napříč krycím sklem, což znamená, že existuje menší šance na posunutí vzorku, zejména při získávání Z-stohů.
Glycerolové imerzní objektivy
Obrázek 8: Glycerolové objektivy jsou dobrou volbou pro vzorky namontované v médiu s indexem lomu blízkým indexu lomu směsi glycerol / voda (např.VECTASHIELD® Hard + SetTM).
Glycerol je další možné imerzní médium. Mnoho fixovaných vzorků je namontováno v Mowiolu, Vectashieldu nebo podobných směsích na bázi glycerolu (viz tabulka 1). Tato média mají indexy lomu blízké indexům lomu směsi 80/20 glycerol / voda (RI = 1,45). Glycerolové objektivy (viz obrázek 8) jsou nejlepší volbou pro vzorky namontované v takových médiích.
(Převzato ze zahraničního zdroje, redakčně upraveno.)