Autor: Wymke Ockenga (Philipps University Marburg, Institute of Cytobiology and Cytopathology, Německo)
Zviditelnění nebarevných fázových objektů
Fázový kontrast je technika optického kontrastu pro zviditelnění neobarvených fázových objektů (např. plochých buněk) pod optickým mikroskopem. Buňky, které se ve světlém poli objevují jako nenápadné a transparentní, lze prohlížet ve vysokém kontrastu v bohatých detailech pomocí mikroskopu s fázovým kontrastem.
Využití fázových posunů pro tvorbu obrazu
Fázové objekty způsobují fázový posun světla procházejícího vzorkem. Protože pro lidské oko nebo fotodetektory jsou viditelné pouze posuny amplitudy (rozdíly v intenzitách), barvení vzorku by zprostředkovalo posun amplitudy a rozdíl v intenzitě procházejícího světla. Mnoho barvicích činidel je však pro živé buňky toxických. Mikroskopie s fázovým kontrastem nabízí možnost použít fázové posuny způsobené rozdíly v délce optické dráhy, aby byl vzorek viditelný pod optickým mikroskopem. Mění fázové posuny na amplitudové přes interferenci výsledných světelných vln.
Technika mikroskopie s fázovým kontrastem byla vyvinuta ve 30. letech nizozemským fyzikem Fritsem Zernikeem. Poté, co byla tato technika uvedena do provozu v roce 1942, získal Zernike v roce 1953 Nobelovu cenu za fyziku.
Obr. 1a: MDCK buňky, mikroskop s fázovým kontrastem
Obr. 1b: MDCK buňky, světelný mikroskop
Obr. 1c: Amoeba Proteus, mikroskop s fázovým kontrastem
Obr. 1d: Amoeba Proteus, světelný mikroskop
Rušení světelných vln
Délka optické dráhy je součinem indexu lomu a tloušťky mezi dvěma body optické dráhy. Souvisí to s časem průchodu a rychlostí světla. Rozdíly v délce optické dráhy vedou k různým rychlostem světelných vln při průchodu vzorkem (tj. Fázový posun). Výsledkem jsou rozdíly ve fázi. Vyšší index lomu ve srovnání s okolním médiem vede ke zpomalení světelné vlny a zpomalení její fáze.
Interference popisuje interakci dvou vln navzájem a výslednou tvorbu nového vlnového vzorce podle principu superpozice. Relevantním parametrem pro interferenci světelných vln je amplituda světelných vln. Pokud dvě vlny interferují, bude se amplituda výsledné světelné vlny rovnat vektorovému součtu amplitud obou interferujících vln.
Pokud se amplituda výsledné vlny zvýší, bude interference popsána jako konstruktivní. Bude tomu tak v případě, že se ve stejném okamžiku setkají buď dva vlnové hřebeny, nebo dvě vlnová koryta. Je také možné, že se hřeben jedné vlny a koryto jiné vlny setkají ve stejném časovém okamžiku. To vede ke snížené amplitudě výsledné vlny. Interference mezi těmito dvěma vlnami se pak nazývá destruktivní.
Optická cesta v mikroskopu s fázovým kontrastem
Klíčovými prvky mikroskopu s fázovým kontrastem jsou otvor mezikruží a fázová destička. Otvor mezikruží je umístěn v přední ohniskové rovině kondenzátoru a omezuje úhel pronikajících světelných vln. Fázová deska leží v zadní ohniskové rovině objektivu a má fázový prstenec vyrobený z materiálu, který tlumí světlo procházející skrz a mění svou fázi o λ / 4. λ představuje vlnovou délku světla.
Ve fázové kontrastní mikroskopii za podmínek Köhlerova osvětlení jsou světelné vlny, které neinteragují se vzorkem, zaostřeny jako jasný prstenec v zadní ohniskové rovině objektivu. Světelný prstenec prostorově odpovídá fázovému kruhu podél optické osy a způsobuje fázový posun nevychýleného světla. Světlo, které je rozptylováno vzorkem, nenaráží převážně na fázový kruh, a proto není ovlivňováno.
Mezi ovlivněnými a neovlivněnými světelnými vlnami dochází k celkovému fázovému posunu až λ / 2. Fáze nevychýleného světla je na fázovém prstenci posunuta o λ / 4 a vlny rozptýleného světla jsou obvykle zpomaleny o λ / 4 biologickými vzorky. Celkový fázový posun λ / 2 umožňuje destruktivní interferenci světelných vln v obrazové rovině. Pro ztlumení nevychýleného světla procházejícího fázovým prstencem je důležité zabránit stínění nevychýleného světla ve srovnání s vychýleným světlem.
Fázový posun λ / 2, jak je pozorován ve fázové kontrastní mikroskopii, vede k maximálnímu ničivému interferenčnímu účinku, protože hřeben a koryto se účinně setkávají ve stejném časovém okamžiku. Proto je amplituda světelné vlny snížena a fázový posun fázového objektu je transformován do amplitudového posunu.
Obr. 2: Optická cesta v mikroskopu s fázovým kontrastem. Kruhové světlo, které prošlo prstencem kondenzátoru, je kondenzátorem zaměřeno na vzorek. Části prstencového světla jsou rozptýleny opticky hustými strukturami vzorku (např. plazmatické membrány, organely atd.) a dochází k fázovému posunu přibližně ¼ λ (obvyklý pro biologický vzorek). Toto fázově posunuté a rozptýlené světlo obchází fázový prstenec a je fázovým prstencem těžce ovlivněno (většinou umístěné v zadní ohniskové rovině objektivu). Naproti tomu přímé prstencové světlo z mezikruží kondenzátoru zasáhne fázový prstenec, který ztlumí přímé světlo a způsobí fázový posun (obvykle pro pozitivní fázový kontrast postupuje o ¼ λ nebo zpomaluje o ¾ λ). Protože celkový fázový posun mezi světlem lomeným vzorkem a světlem, které prošlo fázovým prstencem, bude až ½ λ, dojde k destruktivní interferenci. Opticky husté struktury budou následně vypadat tmavší (v pozitivním fázovém kontrastu).
Obr. 3: Fázový prstenec je centrální součástí mikroskopu s fázovým kontrastem. Obvykle se skládá ze šedého filtru a zádržné desky. Část světla, která prošla vzorkem bez difrakce, prochází fázovým prstencem (šipka vlevo). Šedý filtr ztlumí světlo, aby se zabránilo ozáření. Retenční deska zpomaluje fázi nedifrakčního světla, aby umožnila interferenci se světelnými vlnami, u kterých došlo k fázovému posunu a difrakci průchodem vzorku (šipka vpravo).
Pozitivní a negativní – dvě formy fázového kontrastu
Existují dvě formy fázového kontrastu: pozitivní a negativní fázový kontrast. Liší se hlavně fázovými deskami používanými pro osvětlení. V pozitivním fázovém kontrastu posouvá fázová destička o optické tloušťce 3/4 vlnové délky fázi přímého vlnění o + 90°. V negativním fázovém kontrastu posouvá fázová destička o optické tloušťce 1/4 vlnové délky fázi přímého vlnění o – 90°. Zpoždění fáze v negativním fázovém kontrastu vede ke zničení fázových rozdílů. Světelné vlny jsou ve fázi a místo destruktivního rušení dochází ke konstruktivnímu rušení. To vede ke zvýšené amplitudě výsledné světelné vlny.
V kontrastní mikroskopii s pozitivní fází jsou objekty s indexem lomu vyšším než okolní médium zobrazeny tmavší než objekty s nižším indexem lomu. Pro negativní fázový kontrast platí opak.
Interpretace obrazu fázového kontrastu
Mikroskopie fázového kontrastu vizualizuje rozdíly v délce optické dráhy vzorku. Délka optické dráhy souvisí s tloušťkou vzorku a indexem lomu. Buněčné struktury, jako jsou plazmatické membrány a organely, mají zásadní vliv na délku optické dráhy. Protože mnoho buněk (zejména v buněčných kulturách) má plochý a pravidelný tvar, jsou ve světelné mikroskopii stěží viditelné.
Fázový kontrastní obraz takových buněk zesiluje rozdíly v buněčné struktuře a lze jej považovat za mapu optické hustoty, protože optická hustota má velký vliv na index lomu vzorku nebo materiálu. Několik efektů však komplikuje správnou interpretaci obrazu fázového kontrastu, protože se přímo nespoléhají na rozdíly v délce optické dráhy.
Halo efekt popisuje vzhled jasného okraje pro pozitivní fázový kontrast nebo tmavého okraje pro negativní fázový kontrast kolem velkých objektů. Halo efekt se tvoří, protože část rozptýleného světla ze vzorku prochází také fázovým prstencem. Prstenec světla tvořený nevychýlenými vlnami je o něco menší než fázový prstenec, a nízkofrekvenční rozptýlené světelné vlny ze vzorku tak mohou procházet prstencem. Odchýlené světlo procházející fázovým prstencem udržuje fázový rozdíl 90 °, a proto není ovlivněno destruktivním rušením. To vede k obrácení kontrastu a způsobí halo efekt na hranicích velkých objektů.
„Stínový“ efekt popisuje situaci, kdy jsou homogenní části vzorku zobrazeny se stejnou intenzitou světla jako okolní médium. I když světlo procházející těmito oblastmi prochází fázovým posunem, dochází pouze k malé difrakci a úhel rozptylu je značně snížen. Proto tyto světelné vlny vstupují do fázového prstence jako nevychýlené světlo a nedochází k rušení.
Dalším problémem ve fázové kontrastní mikroskopii může být inverze kontrastu. Pokud existují objekty s velmi vysokým indexem lomu vedle objektů s nízkým indexem lomu, budou vypadat jasněji než tmavěji (pro pozitivní fázový kontrast). V takových oblastech není fázový posun obvyklým posunem λ / 4 pro biologické vzorky a místo destruktivní interference dochází ke konstruktivní interferenci (opačná pro negativní fázový kontrast).
Ačkoli tyto efekty mohou ztěžovat interpretaci obrazů fázového kontrastu, mikroskopie fázového kontrastu je pohodlnou a důležitou technikou optického kontrastu pro zobrazování fázových objektů. Mikroskopie fázového kontrastu navíc umožňuje zkoumání buněčných funkcí a struktur v živých vzorcích, což z ní činí nejčastěji používanou kontrastní metodu v biologickém výzkumu.
Obr. 4a: Aspergillus,mikroskopie fázového kontrastu
Obr. 4b: Rat testicles, mikroskopie fázového kontrastu
Obr. 4c: Phaseolus vulgaris, mikroskopie fázového kontrastu
(Převzato ze zahraničního zdroje, redakčně upraveno.)