Metoda ELISA - aspekty jednotlivých uspořádání

Metoda ELISA (z angl. enzyme-linked immunosorbent assay), je jednou z nejvíce využívaných imunochemických metod. Vznikla na začátku sedmdesátých let minulého století jako náhrada imunochemických testů využívajících radionuklidy pro značení protilátek. Název napovídá, že se využívá kromě imunochemické interakce antigen-protilátka také přítomnosti enzymu, nejčastěji křenové peroxidasy či alkalické fosfatasy. Jde o rychlou a jednoduchou laboratorní techniku, která je jednou z nejcitlivějších imunoanalýz používaných na poli laboratorního výzkumu, diagnostiky biomarkerů nejrůznějších onemocnění či kontroly kvality v různých odvětvích průmyslu. Metodu ELISA lze využít v několika různých uspořádáních (obr.1). Cílem tohoto článku je rychlé seznámení s aspekty jednotlivých uspořádání a vzájemné srovnání výhod a nevýhod daných technik.

K měření se nejčastěji využívají 96-jamkové mikrotitrační polystyrenové destičky, na jejichž povrch lze snadno imobilizovat reagencie. Dostupné jsou také 384-jamkové mikrotitrační polystyrenové destičky. To, že lze reagencie imobilizovat na povrchu jamek destiček je velkou výhodou této metody, protože umožňuje následně jednoduše oddělit navázaný materiál od nenavázaného a promýt nespecificky navázaný materiál. V praxi jde o střídání inkubačních dob s promýváním zakončeným měřením signálu spektrofotometricky, fluorimetricky nebo luminometricky. Jde tedy o mocný nástroj pro specifické měření analytů bez náročné přípravy vzorku. Pro zesílení signálu analytu lze použít protilátku v mnoha vrstvách.

Přímá ELISA

Prvním a nejjednodušším uspořádáním metody ELISA je přímé (Obr.2). V ní dochází k reakci antigenu imobilizovaného na pevný povrch s protilátkou značenou enzymem, který následně reaguje například s chromogenním substrátem za vzniku měřitelné barevné změny.

Obr.2.: Schématické znázornění přímé ELISA. Vazba antigenu (vlevo), přídavek enzymaticky značené protilátky (uprostřed), přídavek substrátu (vpravo). ⁴

• Přímé uspořádání metody ELISA v krocích:

Krok 1 – inkubace, dochází k navázání antigenu na pevný povrch jamky

Krok 2 – promytí

Krok 3 – inkubace, dochází k vazbě antigenu a enzymaticky značené protilátky

Krok 4 – promytí, dochází k odstranění nenavázané protilátky

Krok 5 – inkubace, dochází k reakci enzymu se substrátem

Krok 6 – detekce

Uspořádání přímé ELISA lze použít pro kvalitativní i kvantitativní stanovení antigenu či protilátky ve vzorku, ale také ji lze využít k mapování epitopů. Obvykle bývá méně časově náročné než další uspořádání. Z hlediska použití jediné protilátky je metoda jednodušší, cenově dostupnější. Přímá ELISA je nejlepší možností pro analýzu imunitní odpovědi na antigen.

Nepřímá ELISA

Druhou a nejvíce využívanou možností je uspořádání nepřímá ELISA (Obr.3), ve kterém se kromě primární protilátky používá také sekundární protilátka značená enzymem.

Obr.3 Schématické znázornění nepřímé ELISA metody. Vazba antigenu na povrch jamky (vlevo), přídavek primární protilátky (2. pozice), přídavek enzymaticky značené sekundární protilátky (3. pozice), aplikace substrátu (vpravo).⁴

• Nepřímé uspořádání metody ELISA v krocích:

Krok 1 – inkubace, dochází k navázání antigenu na pevný povrch jamky

Krok 2 – promytí

Krok 3 – inkubace, dochází k reakci antigenu s primární protilátkou

Krok 4 – promytí, dochází k odstranění nenavázané protilátky

Krok 5 – inkubace, dochází k navázání sekundární protilátky značené enzymem na primární protilátku

Krok 6 – promytí, dochází k odstranění nenavázané protilátky

Krok 7 – inkubace, dochází k reakci enzymu se substrátem

Krok 8 – detekce

ELISA v nepřímém uspořádání má vyšší citlivost, protože se na primární protilátku může vázat více než jedna značená sekundární protilátka. Z hlediska potřeby univerzální značené protilátky se jeví ekonomičtější. Poskytuje větší flexibilitu, protože různé primární protilátky mohou být použity s jednou značenou sekundární protilátkou. Mezi nevýhody nepřímého uspořádání patří možnost zvýšeného šumu pozadí vlivem křížové interakce sekundární značené protilátky s imobilizovaným antigenem. Nepřímé testy ELISA vyžadují další inkubační krok pro sekundární protilátku, jsou tedy časově náročnější. Nepřímý test ELISA je nejvhodnější pro stanovení celkové koncentrace protilátek ve vzorcích.

Sendvičová ELISA

Třetí nejčastěji využívanou možností uspořádání metody ELISA je sendvičové (Obr. 4). Charakteristické je použití dvou protilátek specifických na různé epitopy jednoho antigenu. Jedna z protilátek je navázána na povrch jamky destičky a vychytává antigen ze vzorku. Druhá protilátka značená enzymem slouží k detekci tohoto antigenu. Antigen je tedy mezi protilátkami jako plátek masa mezi houskami v sendviči.

Obr. 4 Schématické znázornění přímé sendvičové ELISA. Vazba protilátky na destičku (vlevo), vazba antigenu na protilátku (2. pozice), přídavek enzymaticky značené protilátky (3. pozice), přídavek substrátu (vpravo). ⁴

• Sendvičové uspořádání metody ELISA v krocích:

Krok 1 inkubace, dochází k navázání jedné z protilátek na pevný povrch jamky

Krok 2 promytí

Krok 3 inkubace, dochází k reakci antigenu s imobilizovanou protilátkou

Krok 4 promytí, dochází k odstranění nezreagovaného antigenu

Krok 5 inkubace, dochází k navázání druhé protilátky značené enzymem na antigen

Krok 6 promytí, dochází k odstranění nenavázané protilátky

Krok 7 inkubace, dochází k reakci enzymu se substrátem

Krok 8 detekce

Pro sendvičové uspořádání lze použít pouze jednu značenou protilátku, potom mluvíme o přímém sendvičovém uspořádání. Stejně tak může být značená protilátka až sekundární proti primární protilátce, pak se bude jednat o nepřímou sendvičovou metodu.

Klíčovou výhodou sendvičového uspořádání metody ELISA je vysoká citlivost, která je 2-5krát citlivější než u prvních dvou variant ELISA. Sendvičové uspořádání ELISA také poskytuje vysokou specificitu, protože k detekci jednoho antigenu se používají dvě protilátky. Není-li k dispozici již otestovaný pár protilátek, musí být nejprve provedena optimalizace protilátek, protože je důležité snížit křížovou interakci mezi záchytnou a detekční protilátkou. Sendvičové uspořádání metody ELISA je obzvláště vhodné pro analýzu komplexních vzorků bez nutnosti náročné purifikace. Přesto poskytuje vysokou citlivost a specificitu.

Kompetitivní ELISA

Čtvrtou možností uspořádání metody ELISA je kompetitivní (Obr.5). K měření koncentrace antigenu se zde využívá interference signálů. Jakékoli z prvních tří uspořádání může být adaptováno na kompetitivní. Uvedeme jeden příklad adaptace, nepřímého uspořádání metody ELISA na uspořádání kompetitivní viz obr.5. Antigen ze vzorku může soutěžit s referenčním antigenem o vazebná místa na primární protilátce.

Referenční antigen je imobilizován na povrchu jamek. Vzorek je nejprve smíchán s protilátkou a poté přidán do jamky. Po ustanovení rovnováhy se analyzovaný vzorek z destičky vymyje. Následně bude přidána sekundární značená protilátka. Čím více primární protilátky bude vyvázáno antigenem ze vzorku, tím slabší bude detekovaný signál.

Obr.5.: Schématické znázornění kompetitivní nepřímé ELISA metody. Vazba definovaného množství antigenu na destičku (vlevo), přídavek směsi protilátek a analyzovaného vzorku (2. pozice), odmytí vzorku (nezobrazeno), aplikace enzymaticky značené sekundární protilátky (3. pozice), přídavek substrátu (vpravo).⁴

• Příklad nepřímého kompetititvního uspořádání metody ELISA v krocích:

Krok 1 – inkubace, dochází k navázání referenčního antigenu na pevný povrch jamky

Krok 2 – promytí,

Krok 3 – preinkubace, dochází k navázání antigenu ze vzorku na primární protilátku

Krok 4 – inkubace, po smíchání preinkubované části v jamce dochází k vychytání volné protilátky referenčním antigenem

Krok 5 – promytí

Krok 6 – inkubace, dochází k navázání sekundární protilátky značené enzymem na primární protilátku

Krok 7 – promytí, dochází k odstranění nezreagované protilátky

Krok 8 – inkubace, dochází k reakci enzymu se substrátem

Krok 9 – detekce

Pro kompetitivní uspořádání metody ELISA se často používají surové, nepurifikované vzorky. Výhodou je, že toto uspořádání není tak citlivé na ředění vzorků a výsledky měření v opakováních vykazují menší variabilitu. Kompetitivní uspořádání jsou užitečná pro měření koncentrace antigenu v komplexních směsích, kdy jsou neznámé vzorky obsahující antigen srovnávány s podobnými vzorky, které obsahují známé množství purifikovaného antigenu. Také se běžně používá v případech, kdy se stanovuje antigen s pomocí pouze jedné protilátky a to z důvodu, že je příliš malý a dvě protilátky ho vázat nemohou nebo protože není k dispozici žádná další protilátka.

Srovnání jednotlivých uspořádání:

Pokud nechcete ztrácet čas výběrem vhodného ELISA kitu, ozvěte se nám, s výběrem vám rádi pomůžeme.

Použité zdroje:

1. Abcam: ELISA guide
2. ThermoScientific: Tech Tip #65, ELISA technical guide and protocols
3. Bio-Rad: Indroduction to ELISA – Basics Guide
4. Bio-Rad: Types of ELISA
5. Creative Diagnostics: ELISA Guide

(Převzato ze zahraničních zdrojů, redakčně upraveno.)