* V celém textu jsou používána anglická slova „gate“ – brána a „gating“, což je výraz pro umělou (elektronickou) selekci pomocí označení určitého prostoru, respektive populace buněk, pro snadnější zobrazení cytometrických dat. Použití nejbližšího českého ekvivalentu “hradlování” odvozeného od softwarových hradlovacích protokolů nám přišlo příliš zavádějící, proto se v textu držíme původního anglického termínu.
Průtoková cytometrie je jednou z nejintenzivněji používaných technik v imunologii, která vytváří velké množství dat v krátkém čase. Umožňuje získat informace o markerech buněčného povrchu, buněčných procesech (jako je apoptóza), signálních drahách a mnoha dalších.
Pro získání spolehlivých výsledků v průtokové cytometrii je nezbytné správně kontrolovat přesný „gating“. Gating znamená izolování specifické skupiny buněk. Toto je obecně manuálně prováděný krok během a po sběru dat. I když může být gating pro hlavní buněčné skupiny, jako jsou buňky CD4+ ve vzorcích PMBC (mononukleární buňky periferní krve), přímý; může být komplikovaný, pokud jde o méně zjevné populace, případně buňky, které mají přechodnou expresi markeru, nebo malé populace buněk.
V tomto blogovém příspěvku Vám chceme předat několik tipů, jak pomocí ovládacích prvků průtokové cytometrie získat úspěšnější gating a následně konzistentnější data.
Před zahájením experimentu si definujte, které buněčné populace vás zajímají.
Jelikož průtoková cytometrie generuje velké množství dat, je obecně doporučeno si předem naplánovat gatingovou strategii. Rozhodnutí, které buněčné populace jsou pro daný experiment relevantní a jaké informace z tohoto experimentu potřebujete, vám pomůže při sběru a analýze dat.
Odstraňte dublety
Jak název napovídá, dublety jsou dvě buňky spojené dohromady. Dokonce i ta nejdůkladnější příprava vzorku může přinést určité množství dubletů. Jejich odstranění je jednoduchý krok: po vykreslení do grafu dle parametrů FSC-A vs FSC-H nebo FSC-A vs FSC-W lze vybrat buňky, které neodpovídají lineární populaci.
Tento krok je zvláště užitečný pro:
• analýzu buněčného cyklu, protože dublety budou ukazovat dvojnásobné množství DNA;
• třídění buněk tak, aby byla namísto dvou tříděna jedna buňka;
• imunofenotypizace, protože dublety mohou mít za následek dvojí pozitivní výsledek (i když jsou jednotlivé buňky jednotlivě pozitivní).
Vytváření “vylučovacího kanálu” (dump channel)
Tzv. dump channel v rámci gatingu vyřadí všechny buňky značené fluorochromem, které nejsou pro daný experiment zajímavé a vyloučí je z analýzy. Například v experimentu, kde se zajímáme o B buňky, je možné obarvit všechny mrtvé buňky, T buňky, makrofágy, dendritické buňky atd. pomocí markerů s jedním vybraným fluorochromem a sloučit je do jednoho kanálu. Je důležité zahrnout do vylučovacího kanálu barvení odumřelých buněk, zvláště pokud je buněčná populace, která nás zajímá, velmi malá. Mrtvé buňky mohou vytvářet autofluorescenci nebo vykazovat neobvyklé markery a mohou tak ovlivnit analýzu.
Izotypové kontroly
Izotypové kontroly jsou protilátky stejného druhu a stejné podtřídy protilátek jako ty použité v testu. Obvykle se používají k vyloučení nespecifické vazby, zejména pak tam, kde jsou ve vzorku makrofágy a vazba na Fc receptor. Doporučuje se použít stejnou koncentraci izotypové kontroly jako analytické protilátky. Ve skutečnosti je to nutné, aby izotypová kontrola přinesla užitek.
FMO kontroly
Kontrola pomocí fluorescence minus jedna (FMO) se provádí obarvením všech fluorochromů daného vzorku v analýze minus testovaný fluorochrom. Jednotlivé fluorochromy jsou pak odstraňovány ze vzorku po jednom (například: fluorochromy – A, B, C, D; FMO – ABC_, AB_D, A_CD, _BCD). Pokud je v testu použito více fluorochromů, vždy existuje riziko překrytí mezi kanály nebo přelévání fluorescence, které může ovlivnit analýzu dat. Kontrola FMO je k vyřešení takových případů velmi užitečná.
Navíc, pokud jsou antigeny exprimovány v poměrech nízký vs. vysoký, nemusí být FMO kontroly úplně nutné. Pokud však existuje přechodná exprese markerů, může být velmi užitečné nastavit správné brány – gates.
Biologické nebo pozitivní kontroly
Posledním návrhem je zahrnout biologické kontroly do kontrol stavu buněk, aktivačních markerů, vzorků s / bez inhibitorů atd., a tak zjistit, zda neexistuje nějaký obecný problém se vzorky, spíše než problém s nastavením průtokové cytometrie.
V tomto příspěvku jsme chtěli dát několik návrhů na kontroly relevantní pro experimenty v průtokové cytometrii. Všechny nemusí být pro danou situaci nutné, ale je dobré si projít jejich seznam před plánováním experimentu v průtokové cytometrii, abyste zjistili, které by vám mohly vyhovovat.
(Převzato od společnosti Nordic BioSite, redakčně upraveno.)