Imunohistochemie (IHC)

Krok 73: Používat vysoce kvalitní řezy

Pro IHC jsou požívány tenké rovné, správně vysušené řezy. Skla jsou buď nabitá, nebo potahovaná (silanizovaná).

 

Špatně natažené řezy se barví nerovnoměrně s variabilně obarveným pozadím.

 

Obr. A) Bublina, která vznikla pod řezem při napínání na sklo, způsobila oddělení části tkáně od skla a její přebarvení (tonsila, CD45). B) Nekvalitní řez, který nebyl rovný a správně vysušený. Části řezu jsou potrhané a poplavané (tonsila, CD3).

 

Krok 74: Zajistit optimální fixaci

Kvalitní fixace za použití známých a konzistentních podmínek (druh fixativa, pH, teplota, čas) vede k nejlepším výsledkům. Vzorky by měly být před zpracováním zkontrolovány, aby se zjistilo, zda je potřeba další fixace nebo nikoliv.

Nekonzistentní podmínky fixace mají za následek nedofixované či naopak přefixované tkáně. To vede k variabilitě výsledků a problémům spojeným s hledáním řešení.

Obr: Nestejnoměrná fixace (zónová fixace) zvpůsobila nestejnoměrné barvení (tumor mammy, ER).

 

Krok 75: Zamezit problémům s přilnavostí řezů

Při napínání řezů v lázni se vyvarujeme použití adheziv na proteinové bázi (různá lepidla, škrob nebo želatina).

 

Taková adheziva mohou zablokovat povrch nabitého podložního sklíčka a zapříčinit špatnou přilnavost řezu. Následně mohou způsobit i zadržování IHC činidel pod nadzvednutými částmi tkáně. Výsledkem toho je nerovnoměrné barvení.

Obr: Ke tkání těsně přiléhající silná vrstva adheziva na bázi proteinu, která se nespecificky obarvila (mamma, PR).

 

Krok 76: Optimalizovat odstraňování parafínu a používání činidel

Pro dosažení konzistentních výsledků je třeba optimalizovat deparafinaci a hydrataci řezů a dávkování a rovnoměrnou distribuci činidel po povrchu tkáně.

Neúplné odstranění parafínu může vést ke vzniku špatně zbarvených oblastí v řezech.

Obr: A) Slabý reagenční tok způsobil nestejnoměrné zbarvení (tonsila, CD45). B) Zbytkový parafín v řezu způsobil neobarvenou oblast (tonsila, CD5). C)Bublina v primární protilátce způsobila nestejnoměrné zbarvení (tonsila, CD20).

 

Krok 77: Vyhnout se koncentračním gradientům

Koncentračnímu gradientu se lze vyhnout správnou aplikací reagencií na sklo..

 

„Občas pozorujeme, že jeden konec řezu je obarven více než druhý.“

 

Obr: A a B jsou mikrofotografie pořízené z opačných konců stejného sklíčka. Jeden konec (A) ukazuje velmi silné zbarvení, zatímco druhý konec (B) zbarvení velmi slabé. Je to extrémní příklad koncentračního gradientu vytvořeného při barvení. (tonsila, CD45).

 

Krok 78: Pečlivě vybírat protilátku

Při výběru protilátky klademe důraz zejména na citlivost a specifitu. Protilátky nabízené různými dodavateli pod různými názvy mohou pocházet z téhož zdroje. Při hodnocení protilátky je nutno použít název klonu.

„Zajímá nás pouze cena produktu.“

 

Obr: Tyto řezy lidské tonsily z jednoho bloku byly barveny na průkaz znaku CD20 proti B lymfocytům za použití monoklonálních protilátek od různých výrobců. V obou případech byl použit doporučený postup i optimalizované ředění. Rozdíl ve výsledné kvalitě zbarvení je zřejmý.

 

Krok 79: Číst návody k protilátkám

Návod by měl být přiložen k protilátce nebo by měl být volně ke stažení na internetu. V tomto dokumentu by měla být uvedena základní metodika k použití protilátky. Se zakoupením nové šarže protilátky by se měla provádět kontrola případných změn.

„Nemáme přístup k návodům od protilátek.“

Obr: Tyto řezy tenkého střeva byly barveny protilátkou proti cytokeratinu AE1/AE3. Pro každý řez byly použity různé podmínky odmaskování epitopu. Řez A vykazuje nepřijatelně slabé zbarvení, zatímco řez B má správně silnou pozitivitu v povrchovém epitelu.

 

Krok 80: Optimalizovat odmaskovací metody

Pro jednotlivé protilátky jsou stanoveny vhodné podmínky pro odmaskování epitopu (pH, pufry, teplota, čas, tlak).

 

„Předpokládáme, že existuje univerzální HIER metoda a pro všechny primární protilátky používáme tutéž odmaskovací metodu.“

Obr: Řezy prostaty obarvené na cytokeratin HMW, klon 34βE12. Řez A ukazuje slabé zbarvení, zatímco řez B má zbarvení silnější a ostřejší. Jediný rozdíl byl v použití odmaskovací metody.

 

Krok 81: Brát v úvahu křížovou reaktivitu protilátek

Bereme v úvahu možné problémy způsobené křížovou reaktivitou protilátek (přečteme si specifikační list).

 

Nesnažíme se vysvětlit, proč při barvení došlo k neočekávané pozitivní reakci ve strukturách, které by pozitivní být neměly.

 

Obr: Patrová tonsila – baze krypt – obarveny CD5 lymfocyty, značí zejména T-buňky. Tento konkrétní klon (4C7) křížově reaguje s epiteliálními buňkami krypt.

 

Krok 82: Blokovat endogenní peroxidázy

U detekčních systémů využívajících křenovou peroxidázu je třeba blokovat endogenní peroxidázu, aby nedošlo k falešně pozitivní reakci tkáně.

Nespecifické barvení lze často pozorovat v erytrocytech, granulocytech, monocytech a ve svalech a je způsobeno nekompletním blokováním endogenní peroxidázy.

Obr: Slezina s typickým, nespecifickým zbarvením erytrocytů kvůli nedokonalé blokaci aktivity endogenní peroxidázy. V tomto případě endogenní peroxidáza erytrocytů, reagovala s DAB chromogenem.

 

Krok 83: Předcházet falešnému barvení pozadí

Vždy je používán adekvátní Protein-Blok.

 

Nespecifické zbarvení pozadí je občas přítomno kvůli nedostatečnému blokování proteinů.

Obr: Běžná tonsila obarvená protilátkou proti lehkému řetězci kappa. Velké nespecifické barvení pozadí vzniklo v důsledku neefektivního blokování proteinů.

 

Krok 84: Používat vhodný detekční systém

Vhodný detekční systém zajistí přesné specifické barvení s odpovídající citlivostí.

 

„Používáme jeden detekční systém už dlouhou dobu a nemáme důvod jej měnit. Některá barvení jsou slabá nebo neostrá, ale s tím už počítáme.“

Obr: Řezy A a B jsou ze stejného vzorku, ale byly obarveny různými detekčními systémy. Povšimněte si odlišností v intenzitě a přesnosti zbarvení. (tonsila, CD20).

 

Krok 85: Standardizovat promývání

Konzistentních výsledků je dosaženo, pokud jsou dodrženy podmínky promývání mezi jednotlivými kroky (čas, objem pufru a intenzita promývání.

Pokud jsou výsledky velmi variabilní v rámci jednoho barvícího cyklu se stejnou protilátkou i mezi cykly prováděnými v různých dnech, může to být způsobeno různými promývacími technikami, které požívají různí laboranti.

Obr: Řezy A a B jsou ze stejného vzorku a byly obarveny manuálně za použití stejných reagencií. Všimněte si rozdílů v úrovni zbarvení pozadí ve stratifikovaném epitelu. To je způsobeno pravděpodobně různou účinností promývání jednotlivých skel. (tonsila, CD20).

 

Krok 86: Optimalizovat dobarvení jader

Síla jaderného barvení je nastavena tak, aby nedocházelo k zastínění slabého pozitivního (specifického) barvení. Dobarvení by mělo poskytnout nejlepší možný kontrast mezi chromogenem a pozadím tkáně. Pro každý použitý chromogen se zvolí vhodná metoda dobarvení (hematoxylin, jádrová červeň, methylzeleň apod.).

Jádra jsou někdy přebarvena a intenzivní barvení může způsobit překrytí slabého specifického signálu.

 

Obr: Tonsila zbarvená na Ki67, buněčný znak proliferujících buněk. Oba řezy jsou ze stejného bloku a ukazují různou úroveň dobarvení jader hematoxylinem. Řez A ukazuje barvení, které je příliš silné a které může skrýt slabou pozitivní reakci. Řez B ukazuje lepší variantu.

 

Krok 87: Používat vhodnou kontrolu

Použití vhodných pozitivních a negativních kontrol vede ke kvalitnímu ověření výsledků barvení. Vnitřní pozitivní a negativní kontroly jsou také důležité a nabízejí výtečný způsob, jak zajistit kvalitu v IHC.

„Provádíme kontroly, pouze když se zdá, že naše metoda nefunguje. Kdybychom je udělali na každém skle, stálo by to moc peněz a stejně by se na ně nikdo nedíval. „

Obr: Tonsila barvená na Ki67. Toto byla negativní kontrola a jádra by se neměla barvit. Na tento řez bylo namísto negativní kontroly chybně aplikována primární protilátka.

 

Krok 88: Výsledky vyhodnocovat opatrně

Je nám dobře známo, co a kde máme hledat při vyhodnocování výsledků barvení vzorků i kontrol.

 

Spokojíme se s tvrzením, že uspokojivý výsledek barvení je takový, kde je cokoliv jakkoliv obarveno.

 

Obr: Střevo barvené na AE1/AE3. Pozorujeme neočekávaně slabé zbarvení epitelu krypt. Při bližším zkoumání bylo zjištěno, že byla špatně použita primární protilátka proti CK20.

 

 

Máte další otázky?
Ozvěte se nám.
Mgr. Zuzana Manhartová

Mgr. Zuzana Manhartová

+420 735 177 202
zmanhartova@baria.cz