Zmrazování biologických vzorků

vytvořeno: 27.4.2021

Autor: Miles Cunningham

 

Aby dokázali určit polohu detailů v mozku sledovaných pod mikroskopem, potřebují obvykle výzkumníci z oblasti neurovědy vidět plátky celého mozku. Pokud není použit mikrotom s vibrační čepelí, který je mnohem pomalejší, je mozek potřeba předem vytvrdit, aby bylo možné nakrájet tenké plátky. Sycení parafínem funguje pouze pro malé nebo tenké vzorky tkáně, parafín totiž nepronikne do centra celého mozku hlodavců. Výzkumníci z neurověd tedy obvykle pro krájení používají zmrazení k vytvrzení mozkové tkáně.

 

Tři pevné formy vody

Zmrazení poškozuje buněčné membrány a snižuje histologickou čitelnost biologických vzorků. Tato diskuse je o tom proč, o důsledcích a o tom, jak minimalizovat nebo se vyhnout poškození při použití zmrazení jako prostředku k vytvrzení biologické tkáně za účelem řezání tenkých řezů pro histologii.

Čistá voda může existovat v pevném stavu ve třech formách. Existují dvě krystalické formy, hexagonální krystal a kubický krystal. Voda také může být zmrazena tak rychle, že nemá čas na tvorbu krystalů a zůstává amorfní (sklovitá forma). Tvorba krystalů je zodpovědná za expanzi vody při jejím zmrznutí (expanze při zmrazení je jedinečnou vlastností právě vody), nicméně sklovitý led se po tuhnutí neroztahuje. To z něj činí jedinou žádoucí formu zmrazení biologických vzorků.

 

Hodnota kritického zmrznutí

Expanze vodního obsahu zmrazením roztahuje a proniká do buněčných membrán. Pomalé zmrazování podporuje tvorbu ledových krystalů a tím i expanzi. Biologické materiály jsou špatné tepelné vodiče. Je proto pravděpodobné, že budou při zmrazení vzorku existovat tepelné přechody a uvnitř jakéhokoliv kousku tkáně se vytvoří nějaké ledové krystaly více než 10 mm od zdroje chladu. Vzorky umístěné na chladný povrch pro zmrznutí budou mrznout pomalu a budou tedy pravděpodobně vytvářet krystaly, zejména v částech nejvíce vzdálených od mrazícího povrchu. V pomalu zmrazené tkáni s velkými formacemi krystalů bude vznikat během řezání dobře známý efekt „ementálského sýra“, tedy velké množství děr a ztráty obsahu buněk v závislosti na stupni a velikosti tvorby krystalů.

Všimněte si, že v první řadě je kritická rychlost zmrazení, nikoli konečná teplota. Rychlé zmrazení závisí na procentuálním podílu celkové plochy ve styku s chladícím zdrojem, objemu vody, počáteční teplotě vody (vzorku) a na tom, jak hodně je zdroj studený. Ideálně má studený zdroj extrémně nízkou teplotu a je uspořádán tak, aby se dotýkal celého povrchu.

 

Obr. 1: Artefakt ledových krystalů v části kosterního svalu

Obr. 2: “Okenice” ve zmrazeném řezu způsobené krájením příliš studeného bloku

Obr. 3: Vrstvy hustého skleněného ledu. Zdroj: www.deviantart.net

 

Řezání provádějte co nejdříve

I když je vzorek úspěšně rychle zmrazen do sklovité formy, nemusí tak zůstat. Stav sklovitého ledu je nestabilní. Při teplotě nad -121 °C se amorfní led začíná postupně restrukturalizovat do kubického ledu a expandovat. Při teplotě nad -80 °C se kubický led začíná restrukturalizovat do hexagonálního ledu a znovu se expanduje. Naštěstí se jedná o pomalý proces přeměny, který závisí na teplotních gradientech a čistotě vody.

U většiny běžných aplikací musí být tkáň zahřátá na teplotu mrazu, aby bylo možné ji řezat (-9 až -19 °C pro mozek, ale záleží na typu tkáně). Jinak je pro řezání příliš studená a při ohnutí zkosením nože se roztříští. Viditelným příznakem řezání příliš studené tkáně jsou „okenice“ nebo střepy paralelní s ostřím nože. Krájení by mělo začít, jakmile je tkáň dostatečně teplá, aby se mohla řezat. Tkáň by nikdy neměla být ponechána přes noc nebo po delší dobu v kryostatu, i když neprobíhá rozmrazovací cyklus. Začne přeměna ze sklovitého ledu na velké hexagonální krystaly. Krystaly rozšíří objem ledu a poškodí buňky.

 

Tekutý dusík

Nejrychlejším zmrazením je ponoření do kapaliny, což vytvoří největší povrchový kontakt. Druhou přijatelnou možností je umístění na předchlazený kovový podstavec a následné rychlé obklopení tkáně práškovým suchým ledem pro maximalizaci kontaktu s povrchem.

Tekutý dusík je jednou z nejchladnějších běžně dostupných kapalin. Nemísí se s tkání. Tyto vlastnosti z něj činí ideální mrazicí médium. Kapalný dusík má však extrémně nízkou specifickou tepelnou konstantu. Výsledkem je, že se lokálně a vydatně vaří v místě kontaktu i s malým kouskem teplejší tkáně. Jedním z důsledků je, že na rozhraní tkáně a kapalného dusíku může vznikat izolační vrstva páry, resp. plynného dusíku (Leidenfrostův jev), a výrazně tak zpomalit pronikání chladu do tkáně, a tedy nepředvídatelně zpomalit rychlost mrznutí. Jako výsledek se často stává, že vnější vrstva tkáně je rychle zmrzlá a sklovitá, ale poté se vytvoří izolační vrstva plynu a chlad proniká dál pomaleji a vnitřní část se pomaleji zmrazí. Tvorba krystalů nutí tkáň uvnitř zmrzlého krunýře expandovat a celý blok praskne. Prasklý blok poukazuje na to, že alespoň nejvnitřnější tkáň zamrzla krystalicky. Všimněte si, že se jedná o problém s velkými bloky tkáně (například celého krysího nebo dokonce i myšího mozku), kapalný dusík však funguje velmi dobře k zmrazení biopsie nebo menších vzorků a je úspěšně používán v klinických histologických laboratořích.

 

Další řešení

Pro větší bloky se spolehlivěji používá široké spektrum jiných kapalin, zejména isopentan chlazený na teplotu -80 °C. Nevytváří izolační vrstvy plynu a pokud je tkáň jen o něco větší než jeden kubický centimetr, zmrzne sklovitě. Úplné ponoření do kapaliny je nezbytné pro maximální kontakt s povrchem a neškodné pro tkáň. Pohyb kapalinou je užitečný.

Dalším řešením je prostupování (permeace či perfuze) tkáně roztoky glycerinu, polyethylenglykolu (nemrznoucí směs), glycerolu nebo sacharózy. Ty naruší tvorbu krystalů a sníží teplotu tuhnutí. Obvykle se používá 30% sacharóza ve fosfátovém pufru, ale pouze s dobře fixovanou tkání, protože osmolarita by nefixovanou tkáň scvrkla.

 

Zdroje

1. Jongebloed, W.L., Stokroos, D., Kalicharan, D., and Van der Want, J.J.L.  Is Cryopreservation Superior Over Tannic Acid/Arginine/Osmium Tetroxide non-Coating Preparation in Field Emission Scanning Electron Microscopy.  Scanning Microscopy 13: 93-109, 1999.

2. Reid N. and Beesley J. Sectioning and Cryosectioning for Electron Microscopy. Practical Methods in Electron Microscopy, Vol 13, Elsevier, Amsterdam

 

(Zdroj originálního textu: Leica Biosystems. Redakčně upraveno.)

Nejlepší tipy pro zamrazování a rozmrazování buněk pro udržení jejich životaschopnosti

Nejlepší tipy pro zamrazování a rozmrazování buněk pro udržení jejich životaschopnosti

Kryokonzervace je zavedená laboratorní technika používaná k uchovávání buněk a jiného biologického materiálu při teplotě blízké teplotě kapalného dusíku (-196°C). Tento článek pojednává o osvědčených postupech pro zamrazování a rozmrazování buněk, aby byla udržena jejich vysoká životaschopnost.

více informací
Rychlokurz epigenetiky – 2. část

Rychlokurz epigenetiky – 2. část

V tomto druhém příspěvku na téma epigenetiky se budeme zabývat metodami, které se používají ke studiu metylace DNA a RNA.

více informací
Rychlokurz epigenetiky – 1. část

Rychlokurz epigenetiky – 1. část

Zatímco obor genetiky se zabývá studiem genů a tím, jak mohou změny v sekvenci genomu vést ke vzniku dědičných a ireverzibilních fenotypů, epigenetika řeší, jakým způsobem dochází ke změnám fenotypu řízenou aktivací či deaktivací genů beze změny základního kódu. V tomto příspěvku popíšeme, co je epigenetika, a také vám nabídneme přehled různých typů možných epigenetických modifikací.

více informací