Úvod do světelné mikroskopie se širokým zorným polem

ÚVOD

Jedna z nejzákladnějších mikroskopických technik je známa jako tzv. “ Widefield Microscopy”, neboli Světelná mikroskopie se širokým zorným polem(WF). Jde v podstatě o jakoukoli techniku, při které je celý sledovaný vzorek vystaven světelnému zdroji a výsledný obraz je sledován buď pozorovatelem, nebo kamerou (která může být připojena k monitoru počítače).

Cílem tohoto článku je vysvětlit rozdíly mezi mikroskopem se širokým zorným polem (WF) a konfokálním mikroskopem, zejména pak rozdíly mezi zobrazováním a osvětlením mezi oběma těmito systémy. Článek se rovněž zabývá konfigurací mikroskopů se širokým zorným polem, konkrétně použitých světelných drah a problémy se světlem mimo rovinu zaostření.

Pokročilejší techniky WF, jako je WF Super-Resolution, budou zmíněny níže.

Základní porovnání mezi mikroskopem se širokým zorným polem (WF) a konfokálním mikroskopem

Při mikroskopické technice WF je celý vzorek v mikroskopu vystaven světelnému zdroji (viz. obr.1). Nejzákladnější formou WF mikroskopie je tzv. “mikroskopie světelného pole” (Brightfield, BF), ve které je celý vzorek osvětlen bílým světlem buď seshora (v inverzní konfiguraci) a nebo zespoda (ve standardní konfiguraci).

Konfokální vs. WF osvětlení

Obr.1 Konfokální vs. WF osvětlení. Konfokální: světlo ze světelného zdroje (Ls) je zaostřeno skrz bodovou clonu (Pi) a následně na vzorek (S), který je osvětlen v relativně malém objemu. WF:  Zde je celý objem vzorku vystaven světlu přímo.

V konfokálním laserovém skenovacím mikroskopu pochází světelný zdroj pro excitaci fluorescenčních barviv a proteinů z laserových jednotek, které jsou nedílnou součástí celého konfokálního systému. Hlavní výhody konfokální mikroskopie spočívají v tom, že uživatel může definovat oblast zájmu, což vylučuje nutnost vystavení celého vzorku fluorescenčnímu světelnému zdroji. Kromě toho lze konfokální mikroskop použít k získání optických řezů skrz vzorek, což má za výhodu snížení fluorescence na pozadí.

Standardní WF mikroskopy jsou oproti konfokálním mikroskopům méně složité,, obvykle sestávají z bílého a fluorescenčního světelného zdroje, mikroskopu a kamery (s připojeným počítačem nebo bez něj). V konfokálním systému je samotný mikroskop pouze jednou částí konfigurace, která zahrnuje ještě laserové jednotky, konfokální „skenovací hlavu“ (obsahující bodovou clonu pro vyloučení světla mimo zaostřovací rovinu a fotonásobiče pro sběr fotonů ze vzorku) a počítač pro kontrolu parametrů v systému i pro zpracování obrazu.

Porovnání světelných zdrojů v mikroskopii se širokým zorným polem a konfokální mikroskopii

V konvenčním laserovém skenovacím konfokálním mikroskopu může být potřeba okolo pěti různých laserových zdrojů tak, aby se pokryly excitační délky běžně používaných fluoroforů. Například běžně používaný laser je argon-iontový laser, který může produkovat řadu excitačních vlnových délek, které jsou vybírány filtry. Argon-iontové lasery pokrývají zelené vlnové délky excitačního spektra a jsou používány k excitaci fluoroforů, jako je FITC (fluorescein isothiokyanát). Žluté až červené vlnové délky excitačního spektra jsou pokryty heliem-neonovým laserem, ve kterém se rozsah pohybuje přibližně od 543 do 632 nm. Toto spektrum se používá k excitaci fluoroforů, jako je Texas Red a rodamin.

Před zavedením světelných emisních diod (LED) jako fluorescenčních světelných zdrojů pro mikroskopii WF byly hlavními zdroji excitačního světla plynové obloukové lampy, které jsou dodnes široce využívány. Dvě obloukové lampy, které se běžně vyskytují v mikroskopech WF, jsou rtuťová oblouková lampa (také označovaná jako „rtuťový hořák“ nebo „rtuťová výbojka“) a xenonová oblouková lampa. Rtuťová oblouková lampa poskytuje excitační vlnové délky napříč viditelným spektrem (viz obrázek 2), avšak toto osvětlení není jednotné a hlavní píky jsou uvnitř vlnových délek blízkých ultrafialovým (UV) vlnovým délkám (313, 334, 365, 405, 436 nm) s dvěma dalšími píky v zelené / žluté části spektra při 546 a 579 nm.

Spektrum viditelného světla

Obr.2 : Osvětlení v mikroskopii je dosaženo pomocí určitých světelných zdrojů.  Lasery, výbojky a LED diody mají své výhody i nevýhody, a mohou se výrazně lišit co do jejich emise v celém spektru viditelného světla.

Ve srovnání se rtuťovými výbojkami poskytují xenonové výbojky excitační vlnové délky na většině viditelného spektra, ale píky v tomto rozmezí nedosahují intenzity rtuťových výbojek. Ačkoli xenonové obloukové lampy nedosahují tak daleko do UV části spektra ve srovnání s rtuťovými výbojkami, jejich rozsah excitace je posunutý dále do infračervených vlnových délek.

Ačkoli tyto lampy poskytují pro fluorescenční mikroskopii extrémně intenzivní zdroje světla, mají své vlastní nevýhody. Životnost těchto žárovek je omezena rtuťovým hořákem, který obvykle slouží cca 200 až 300 hodin a xenonovou obloukovou lampou, která má životnost 400 až 600 hodin. Protože mají omezenou životnost, měli bychom pozorně sledovat délku jejich provozu

(i když některé systémy mají vestavěný zapisovač hodin). Při použití plynových obloukových lamp s jejich doporučenou životností existuje nebezpečí exploze trubic. Kromě toho, pokud jsou žárovky pravidelně zapínány  a  vypínány, může to výrazně zkrátit jejich životnost, což je třeba brát v úvahu. Použité obloukové lampy je třeba opatrně zlikvidovat, a mělo by se tak učinit podle předpisů dané laboratoře nebo ústavu

Tyto Leica Science Lab tutoriály ukazují jak na výměnu lamp a jejich vycentrování (Obr.3) :

Videotutorial: Jak vyměnit lampy

Videotutorial: Jak lampy vycentrovat

Výměna rtuťové žárovky

Obr.3: Výměna rtuťové žárovky.

I přes některé z výše uvedených nedostatků je rtuťová výbojka stále považována za základní zdroj světla pro WF fluorescenční mikroskopii, a to především kvůli intenzitě produkovaného světla.

Nová generace světelných zdrojů LED pro mikroskopii poskytuje nejen celé spektrum excitačních vlnových délek (od přibližně 365 do 770 nm), ale také poskytuje intenzitu srovnatelnou s obloukovými lampami. Hlavní výhodou oproti obloukovým lampám je životnost zdrojů LED, které mohou být až 50 000 hodin, a to bez nutnosti zahřívání nebo ochlazování tohoto zdroje. To samozřejmě šetří čas, protože LED jednotku je potřeba nastavit a vycentrovat pouze jednou, a sice při první instalaci tohoto zdroje. A nakonec i odpadní teplo je problémem při používání obloukových lamp, které jsou proto instalovány do speciálního umístění vedle mikroskopu. U LED světelného zdroje je většina elektrického příkonu přeměněna na světlo, čímž se nevytváří prakticky žádné odpadní teplo.

Porovnání obrazu při WF a konfokální mikroskopii

Jak bylo popsáno výše, konfokální skenovací hlava obsahuje řadu fotonásobičových trubic (PMT) pro sběr fotonů ze vzorku. Konfokální skenovací hlava bude obvykle obsahovat alespoň tři PMT, které jsou zodpovědné za sběr červeného, ​​zeleného a modrého světla. Další PMT jsou společné pro sběr přenášeného nebo odraženého světla. PMT nejsou fotoaparáty jako takové, ale jsou tvořeny vakuovými trubicemi, které mají na jednom konci okno pro vstup fotonů a elektronovou multiplikační komponentu v těle trubice (viz obrázek 4). Množství shromážděných fotonů je převedeno na elektrický signál před konečným sestavením a zobrazením obrazu. Mnoho konfokálních systémů je také vybaveno kamerami, které se podobají kamerám používaným pro WF mikroskopii.

Snímání obrazu při WF mikroskopii je usnadněno konvenčnější kamerou založenou na fotodiodách (viz obrázek 4). Digitální mikroskopické kamery obsahují polovodičové detektory. Nejběžnějšími senzory jsou Charge Coupled Devices (CCD), Complementary Metal Oxide Semiconductors (CMOS) a sCMOS (vědecké CMOS). Mezi kamerami CCD a CMOS existuje mnoho podobností, i když zpracovávají obrazový signál různými způsoby, které mohou následně ovlivnit dobu snímání kamery, jakož i faktory, jako je poměr signál-šum. Snímkový kmitočet kamery založené na CCD může být 10krát pomalejší než snímač CMOS kvůli vnitřní povaze jejich funkce. Volba kamery je proto závislá na dynamické povaze zkoumaného vzorku.

Obr.4: V konfokální mikroskopii se fotony shromažďují fotonásobiči (vlevo). Skládají se z vakuových trubic, které mají na jednom konci fotonové vstupní okno a složku znásobení elektronů pro zesílení. Mikroskopické čipy kamery se skládají z milionů fotodiod (vpravo). Hlavním složením fotocitlivé diody je fotoelektrický křemík. Přicházející fotonová energie se používá k excitaci elektronů křemíku, které jsou zase shromažďovány v úložné jímce, a poté přeneseny do zesilovače.

Konfigurace ve WF mikroskopii

Mikroskopy se širokým polem jsou buď vzpřímené, ve kterých je sklíčko osvětleno zespodu, nebo inverzní, ve kterých je sklíčko osvětleno shora, jako na obrázku 5. Tato konfigurace má vliv na vzorek, který lze zkoumat. Vzpřímené mikroskopy se běžně používají pro aplikace s fixními vzorky, upevněné na skleněných podložních sklíčkách. Inverzní mikroskopy byly vynalezeny pro sledování živých buněk. Obvykle se tyto vzorky pěstují v kapalných roztocích. Pouze konfigurace s objektivem usazeným níže a kondenzátorem nad vzorkem zaručuje dostatečnou blízkost objektivu k vzorku.

Vzpřímený mikroskop vs. inverzní mikroskop

Obr.5: Vzpřímený mikroskop obsahuje objektiv výše a kondenzátor pod vzorkem (vlevo). Na inverzním mikroskopu je toto uspořádání obráceně (vpravo).

Epi-fluorescence je termín používaný k popisu fluorescenční mikroskopie, ve které se stejná čočka (objektiv) používá k osvětlení i sběru emitovaného světla ze vzorku. Světlo prochází ze světelného zdroje, prochází sadou filtrů, dichromatickým zrcadlem a objektivem se odráží excitační světlo s kratší vlnovou délkou. Delší vlnová délka emitovaného světla ze vzorku putuje zpět objektivem a prochází dichromatickým zrcadlem, které se obrazí v okuláru a / nebo je sbíráno kamerou.

Techniky trans-osvětlení zahrnují kontrastní metody, jako je fázový kontrast a diferenciální interferenční kontrastní (DIC) mikroskopie. Avšak transfluorescenční mikroskopie je metoda, která není dobře známa, ani dobře používána. Tato metoda vylučuje použití dichromatických čoček a místo toho excitační světlo prochází kondenzátorem a vzorkem, a poté je emisní světlo shromažďováno objektivem. Tato technika však měla mnoho počátečních problémů, především vysokou úroveň pozadí a potíže s optickým přizpůsobením kondenzátoru a cílů [1]. Nejnovější pokroky, které tyto problémy překonaly, vedly k použití transfluorescenčního zobrazování v oblastech, jako je zobrazování in vivo a ve stomatologickém výzkumu [2].

Kontrastní metody v mikroskopii se širokým zorným polem

Kontrastní mikroskopické metody včetně diferenciálního interferenčního kontrastu (DIC) a fázového kontrastního mikroskopu mohou být použity s WF fluorescenční mikroskopií

(viz obrázek 6).

Kombinace fluorescenční WF mikroskopie a kontrastních technik může poskytnout cenné informace a obrázky životaschopnosti a morfologie. Konfokální systém má schopnost současně snímat kontrastní i fluorescenční obrazy, které lze překrýt pomocí softwaru pro analýzu obrazu. Ve fluorescenční WF mikroskopii však současné zobrazení jako je toto, vyžaduje použití adaptéru kamery s rozděleným pohledem, nebo použití dvou samostatných kamer, jednu pro kontrast a druhou pro fluorescenci. Obvykle bude fluorescenční snímek zachycen kamerou, následuje změna optiky na kontrastní osvětlení, a poté stejná kamera zaznamená kontrastní snímek. Tyto obrázky pak lze kombinovat pomocí softwaru pro analýzu obrazu.

Kultura neuronálních buněk v DIC (vlevo), fázový kontrast (uprostřed) a fluorescenční mikroskopie (vpravo)

Obr. 6 : Kultura neuronálních buněk v DIC (vlevo), fázový kontrast (uprostřed) a fluorescenční mikroskopie (vpravo).

Rozlišení v mikroskopii se širokým zorným polem

Rozlišení mikroskopu je jednoduše řečeno schopnost rozlišit detaily ve vzorku. Je to minimální vzdálenost, při které lze dva odlišné body vzorku stále považovat za samostatné entity. Další informace o konceptech a faktorech, určující rozlišení najdete níže.

Stejně jako u všech konvenčních optických mikroskopických systémů (včetně konfokálního) je rozlišení určeno numerickou aperturou (NA) a vlnovou délkou světla. Ve světelné mikroskopii je limit rozlišení kolem 200 nm. V dokonale zarovnaném mikroskopickém systému s nejvyšší optikou NA je limit rozlišení zhruba polovina vlnové délky světla použitého k zobrazení vzorku (nebo excitaci fluoroforů). Při porovnání WF s konfokální mikroskopií jsou teoretické limity rozlišení v obou metodách podobné.

Skutečné rozlišení dosažené mikroskopem WF je však zhoršeno fluorescencí pozadí. Jak je zdůrazněno výše, celý vzorek je osvětlen pod mikroskopem WF, a proto oblasti nad a pod ohniskovou rovinou také fluoreskují a budou zachyceny kamerou, což pozorovatel uvidí. Emise vlnových délek z fluoroforu jako takové mohou být touto fluorescencí pozadí trochu maskovány, což vede k celkovému snížení poměru signál-šum a následnému snížení dosažitelného rozlišení a kontrastu.

V konfokálním systému se bodová clona (uvnitř skenovací hlavy) používá k blokování jakéhokoliv světla mimo oblast zaostření v dosažení detektorů PMT. Ačkoli to má výhodu v tom, že vytváří velice dobře zaostřený obraz blokováním pozadí a autofluorescence, některé fotony mimo zaostření mohou pocházet z ohniskové roviny. To znamená, že některé informace by mohly být kvůli použití bodové clony ztraceny. Mezi ostrými obrazy vytvořenými na konfokálním systému a neúmyslným shromažďováním nezaostřeného světla pomocí mikroskopu WF existuje rovnováha. Avšak pomocí post-akvizičního procesu známého jako „dekonvoluce“ to může vyřešit rozmazání a zaostření (s. Obrázek 7). Tento výpočetní proces může přiřadit fotony jejich výchozímu bodu.

WF mikroskopie před a po “dekonvoluci”

Obr.7 : WF mikroskopie před a po “dekonvoluci”.

Informace navíc aneb stručný pohled na techniky WF FRAP a Super-Resolution

Obnovení fluorescence po fotobělení (FRAP) je technika, která se používá ke zkoumání mobility molekul v průběhu času. Tato technika byla původně používána ke studiu dynamiky a tekutosti lipidových molekul v buněčných membránách, ale může být také použita ke studiu proteinů v organelách nebo cytoplazmě. V experimentu FRAP je fluorescenční sonda kovalentně připojena k požadované molekule, a nebo je cílový protein upraven tak, aby exprimoval fluorofor, jako je zelený fluorescenční protein (GFP).

Jakmile je fluorofor, který je předmětem zájmu, lokalizován, cílová oblast v buňce je záměrně (a nevratně) fotobělena, aby se vymazala veškerá fluorescence. V průběhu času se odbarvená oblast postupně stane fluorescenční, jak se více značených cílových proteinů pohybuje do oblasti, ať už pasivně (difúzí) nebo aktivně (transportem). Tyto experimenty mohou přinést užitečné výsledky při určování pohybů a vlastností proteinů v reálném čase v buněčném prostředí (viz obrázek 8).

Experimenty FRAP

 Obr. 8 : Experimenty FRAP mohou poskytnout vhled do dynamiky molekul. Definovanou oblast fluorescenčních molekul lze nevratně bělit laserem. Následná repopulace odhaluje podrobnosti o difúzních, respektive transportních vlastnostech molekul.

Ačkoli experimenty FRAP byly dříve prováděny pomocí konfokálního mikroskopu, v dnešní době existují i řešení WF. Ve srovnání s konvenčními konfokálními experimenty FRAP mohou zařízení WF FRAP nabízet vyšší rychlost zobrazování pomocí nejmodernějších kamer, a také chránit buňky a oblasti zájmu před nadměrným foto stresem způsobeným konfokálními systémy.

Mikroskopické techniky s vysokým rozlišením jsou ty, které mohou zobrazovat obraz za hranicí rozlišení kolem 200 nm. V posledních letech bylo vyvinuto mnoho technik s vysokým rozlišením, mezi něž patří:

 Lokalizační techniky s jednou molekulou, ve kterých se v průběhu času shromažďují malé podíly fluoroforového signálu, aby se vytvořil konečný obraz. Jak název napovídá, je možné zachytit a zobrazit jednotlivé molekuly, pokud to experimentální podmínky umožňují.

 Strukturovaná světelná mikroskopie (SIM). V této technice jsou vytvořeny vzory ve fázi a amplitudě WF světla. Vzorek, který je zobrazen, také vytváří podobné vzory a interakce mezi generovanými a vzorky založenými vzory je použita pro konstrukci intracelulární struktury.

 Mikroskopie vyčerpání stimulovanou emisí (STED). Tato konfokální technika vyžaduje dva lasery – jeden pro excitaci fluoroforu a další kruhový laserový paprsek, aby „vyčerpal“ emise ze stejného fluoroforu, což má za následek menší oblast snímání obrazu.

Jedna z technik lokalizace jedné molekuly, která je dosažitelná WF mikroskopií, je známá jako mikroskopie s přímou stochastickou optickou rekonstrukcí (dSTORM) nebo také známá jako deplece přízemního stavu, po které následuje samostatná mikroskopie s návratem molekul (GSDIM).

 

GSDIM / dSTORM využívá lasery a fotopřepínatelné fluorescenční sondy, které se vypínají a zapínají k vytváření obrazu v průběhu času. Většina fluorescenčních sond je indukována do energetické úrovně „temného stavu“, při které nemohou emitovat fotony. Zůstanou tak pouze jednoduché a dobře oddělené fluorofory, které lze lokalizovat s přesností nanometrů.

 

Reference:

 

  1. http://www.biolbull.org/content/201/2/235.long
  2. http://www.uc.pt/en/fmuc/phdhs/Courses/bi
Jak dezinfikovat mikroskop

Jak dezinfikovat mikroskop

Současná pandemie nového koronaviru vyvolala spoustu otázek ohledně metod dekontaminace mikroskopů, aby bylo jejich použití co nejbezpečnější. Běžně jsou mikroskopy sdíleny hned několika uživateli a zkoumané vzorky jsou často mikroorganismy, které mohou být infekční.

více informací
Sezení při mikroskopování

Sezení při mikroskopování

Žádný člověk není stejný. Ať už vysoký či malý, mohutnější nebo drobnější, pravák či levák, každý má na nástroj, se kterým pracuje hned několik hodin denně, různé požadavky. Toto platí zejména pak pro pracoviště, kde se provádí rutinní úkoly vyžadující statické držení těla, jako je například pipetování, mikroskopování nebo krájení na mikrotomu.

více informací
Zaostřeno na SARS-CoV-2

Zaostřeno na SARS-CoV-2

Onemocnění COVID-19 a jeho původce SARS-CoV-2 už snad ani není třeba představovat. Vzhledem k tomu, že informací není nikdy dost, rádi bychom s vámi sdíleli 4 krátká review týkající se jeho infekčního cyklu, imunitní odezvy, potenciálních léčiv a výroby vakcíny.

více informací
kategorie: imunologie