V předcházejícím příspěvku na téma sekvenování nové generace (NGS) jsme se zabývali nejdůležitějšími doporučeními pro úspěšné provedení NGS. Tentokrát se podíváme podrobněji na výběr velikosti.
Co je to výběr velikosti?
Výběr velikosti je poměrně nákladově efektivní část pracovního postupu sekvenování nové generace, která může mít obrovský dopad na výsledky pokusu a kvalitu dat. Rozumí se jím vyřazení velikostně nevyhovujících fragmentů nukleových kyselin z knihovny před aplikací na sekvenační platformě. Tím je zajištěno, že fragmenty obsažené v knihovně budou mít velikost v optimálním rozmezí pro konkrétní sekvenovací nástroj; například toto rozmezí je 200-500 bp pro platformy Illumina, avšak u nástrojů Roche mohou mít velikost až 700 bp.
Výběr velikosti by neměl být zaměňován s fragmentací. Fragmentace je proces stříhání (shearing) DNA nebo RNA, který obvykle probíhá před přípravou knihovny NGS. Během fragmentace jsou izolované nukleové kyseliny vystaveny buď enzymatické aktivitě nebo nějaké mechanické síle, která jednoduše rozbije (rozštěpí) izolované nukleové kyseliny do kratších fragmentů. Enzymatické metody mohou umožnit určitou kontrolu nad délkou nastříhaných fragmentů prostřednictvím úpravy reakčního času nebo podmínek. Naopak mechanické metody, jako např. sonikace nebo tzv. focused acoustics, se liší svou schopností produkovat fragmenty v rámci úzkého rozmezí velikostí, ačkoli některé z nich, např. ultrasonikace, přinášejí předvídatelné a úzce distribuované profily stříhání (shearing profiles).
Proč to dělat?
Třebaže je cílem některých předvídatelných fragmentací nebo technik stříhání obejít nutnost výběru velikosti, je důležité mít na paměti, že u profilů stříhání (shearing profiles) budou existovat rozdíly v rámci vzorku, jež mohou ovlivnit budoucí výsledky. Výběr velikosti vám umožní minimalizovat dopad takových rozdílů délky fragmentů v rámci vzorku výběrem fragmentů spadajících do správného rozmezí velikostí pro zamýšlený nástroj za účelem maximalizace kapacity sekvenování a kvality dat.
Výběr velikosti vám pomůže vytěžit maximum ze sekvenačního běhu minimalizací nevyužité kapacity u velmi malých nebo velmi velkých fragmentů, které jsou mimo rozmezí, jež daný nástroj umí číst. Dále pak mohou malé fragmenty s délkou menší než 150 bp snadno tvořit adaptorové dimery a primer-dimer komplexy, což vede k dalšímu vyčerpání sekvenační kapacity a k menšímu množství použitelných dat.
Jak provádět výběr velikosti
V závislosti na aplikaci máme k dispozici v zásadě několik přístupů pro výběr fragmentů v žádoucím rozmezí velikostí a současně pro vyřazení fragmentů o nízké molekulové hmotnosti jako jsou např. dimery, jakož i odstranění nežádoucích enzymů, nukleotidů a složek pufru. Zde je přehled nejběžněji používaných metod pro výběr velikosti:
1. Výběr velikosti pomocí gelu
Tato metoda je sice charakterizována nízkou kapacitou, představuje však spolehlivou a efektivní metodu pro výběr velikosti a nadále zůstává oblíbenou volbou. V tomto případě jsou fragmenty v požadovaném rozmezí velikostí manuálně separovány z agarózového gelu. Marker molekulové hmotnosti slouží jako vodítko pro velikost fragmentu. Výběr pomocí gelu může být prováděn na standardních agarózových gelech, což je časově náročné, nebo lze použít automatizované metody využívající gely, které poskytují větší reprodukovatelnost a šetří čas.
Výběr pomocí gelu se obvykle používá k eliminaci větších fragmentů ze vzorků DNA, tj. větších než 1 000 bp, nebo k eliminaci miRNA a malých frakcí RNA ze vzorků RNA. Jelikož je velikost produktu u miRNA v rozmezí 18-30 bp a je tedy velice podobná velikosti adaptorových dimerů, magnetické kuličky nezajišťují dostatečnou separaci pro tento typ výběru velikosti.
2. Výběr velikosti pomocí magnetických kuliček
Výběr velikosti pomocí magnetických kuliček je nákladově efektivní technika využívající inertní kuličky, které obsahují polystyrenová jádra a jsou potaženy magnetitem a vrstvou karboxylových molekul. V přítomnosti polyethylenglykolu (PEG) a soli se nukleové kyseliny vážou reverzibilně na kuličky. Velikosti fragmentů, které se vážou na kuličky, lze regulovat úpravou poměru PEG, soli a kuliček vůči nukleovým kyselinám.
Nejprve se umožní navázání nukleových kyselin na kuličky, a poté je aplikována magnetická síla, která umožní separaci kuliček, a tím i navázaných fragmentů od zbývajícího materiálu. Požadované fragmenty mohou být poté separovány buď prostřednictvím eluce z kuliček vyvolané změnou v pufru (větší fragmenty) nebo přímo ze supernatantu, obvykle v případě menších fragmentů. Největší výhodou výběru velikosti pomocí magnetických kuliček je skutečnost, že tento postup lze automatizovat a tím dosáhnout vysoké kapacity. Tato metoda se doporučuje pro fragmenty v délce 100 bp a vyšší.
(Převzato od společnosti Nordic BioSite, redakčně upraveno.)
Doporučená literatura
Head S.R. et al. 2014. Library construction for next-generation sequencing: Overviews and challenges. Biotechniques. 56(2): 61–passim. doi: 10.2144/000114133.