Úvod do zpracování histologických vzorků

vytvořeno: 31.8.2020

Úvod do zpracovávání vzorků v tkáňovém procesoru

Mikroskopická analýza buněk a tkání vyžaduje přípravu velmi tenkých, vysoce kvalitních řezů, připevněných na skleněných podložních sklíčkách a vhodně obarvených tak, aby se prokázaly normální a abnormální struktury.

Většina čerstvých tkání je velmi jemná, snadno deformovatelná a lehce poškoditelná. Proto z nich není možné připravit tenké řezy, pokud nejsou chemicky konzervovány nebo „fixovány“ a nějakým způsobem řádně upevněny během procesu krájení. Obecně lze pro tento postup použít dvě strategie.

Můžeme tkáň zmrazit a udržet ji zmraženou i během procesu krájení. Tyto řezy se nazývají „zmražené řezy“.

Můžeme náš tkáňový vzorek infiltrovat kapalným činidlem, které může být následně přeměněno na pevnou látku. Tato látka má vhodné fyzikální vlastnosti, které následně umožní řezání tenkých řezů. Takovým činidlem je parafínový vosk. Tím se získají tzv. „Parafínové řezy“.

Tento článek se zabývá popisem způsobu zpracování tkáně pro vytvoření parafínových bloků vhodných k následnému zpracování krájením. 

ÚVOD

Zpracování tkáně popisuje kroky potřebné k tomu, aby zvířecí nebo lidská tkáň byla zafixována do stavu, ve kterém je zcela infiltrována vhodným histologickým voskem, a může být poté upnuta do mikrotomu a krájena na tenké řezy.

Zpracování tkáně může být provedeno ručně (ruční zpracování). Pokud však potřebujete zacházet s více vzorky, je pohodlnější a mnohem účinnější použítautomatizovaný stroj na zpracování tkáně („tkáňový procesor“). 

Tato zařízení jsou k dispozici od 40. let 20. století1 a pomalu se vyvíjela tak, aby se používala bezpečněji, zvládala větší počet vzorků, zpracovávala vzorky rychleji a produkovala kvalitnější výsledky. 

Existují dva hlavní typy procesorů: 

tzv. ponorné nebo také otevřené tkáňové procesory, kde se tkáně automaticky přenáší z jedné lázně (kyvety) s činidlem do další 

tzv. uzavřené tkáňové procesory, kde jsou vzorky po celou dobu procesu v jedné retortě (komoře) a zde jsou činidla automaticky přiváděna a odváděna pryč

Většina moderních uzavřených tkáňových procesorů využívá další podpůrné funkce jako je zvýšená teplota, účinná cirkulace tekutin nebo třeba vakuum / tlak pro zlepšení zpracování vzorků a zkrácení doby jejich zpracování.

Moderní „uzavřený“ tkáňový procesor.   

 

Ponorný tkáňový procesor, který je stále dobrou volbou pro malé laboratoře.

Význam kvalitního zpracování tkáně

Domníváme se, že většina vedoucích pracovníků v laboratoři by měla zdůraznit svým zaměstnancům důležitost kvalitního zpracování tkáně. Je vhodné zdůraznit, že použitím nevhodného harmonogramu zpracování nebo provedení zásadní chyby může vést k chybnému zpracování vzorků tkání, které nelze poté kvalitně hodnotit, a proto neposkytnou žádné užitečné mikroskopické informace. To může být katastrofální, pokud se zabýváte diagnostikou lidské tkáně, kde byl kompletně celý odebraný vzorek zpracován a již neexistuje žádná další náhradní tkáň. Následkem je, že už pakneexistuje ani žádná diagnóza. Existuje však pacient, kterému musí být poskytnuto vysvětlení.

Přestože se mohou vyskytnout mechanické nebo elektrické poruchy tkáňových procesorů, tím skutečně ohrožujícím aspektem jsou lidské chyby. Je důležité zdůraznit hodnotu řádného vzdělávání a odborné přípravy pro ty, kteří provádějí zpracování tkáně a věnovat zvláštní pozornost při nastavování celého procesoru zpracování tkáně.

 

Krok 1: Alkohol nahrazuje vodu ve všech buňkách.

Krok 2: Xylen rozpouští alkohol.

Krok 3: Parafín nahrazuje xylen. Vzorek je nyní připraven k dalšímu zpracování.

Přehled kroků při zpracování tkáně z parafínových bloků

Získání čerstvého vzorku

Vzorky čerstvé tkáně pocházejí z různých zdrojů. Je třeba poznamenat, že mohou být velmi snadno poškozeny během vyjímání z pacientova těla nebo z těla pokusného zvířete. Je důležité, aby s nimi bylo manipulováno opatrně, a aby byly náležitě fixovány co nejdříve po pitvě či operaci. Ideální fixace by měla být provedena v místě odebrání vzorku ihned nebo pokud to není možné, tak ihned po přepravě do laboratoře.

Fixace

Vzorek se umístí do kapalného fixačního činidla, jako je např. roztok formaldehydu (formalin). Ten pomalu proniká do tkáně a způsobuje chemické a fyzikální změny, které tkáň chrání2. Existuje pouze omezený počet činidel, která mohou být použita pro fixaci, protože musí mít zvláštní vlastnosti, které je činí vhodným pro tento účel. 

Například jednotlivé tkáňové složky si musí zachovat určitou chemickou reaktivitu, aby mohly být následně použity specifické techniky barvení3.  Formalin, obvykle jako fosfátem pufrovaný roztok, je nejoblíbenějším fixačním prostředkem pro uchovávání tkání, které budou zpracovány za účelem přípravy parafínových řezů. V ideálním případě by vzorky měly zůstat ve fixativu tak dlouho, aby fixační prostředek pronikl do každé části tkáně, a poté ještě další čas, aby chemické reakce fixace mohly dosáhnout rovnováhy (fixační čas). Obecně to bude znamenat, že by se vzorek měl fixovat mezi 6 a 24 hodinami. Většina laboratoří používá fixační krok jako první krok ve svém procesoru.

Po fixaci mohou vzorky vyžadovat další přezkoumání a pitvu pro výběr vhodných oblastí pro další vyšetření. Vzorky, které mají být zpracovány, budou umístěny do vhodně označených plastových kazet, aby byl každý vzorek oddělen od ostatních. Trvání celého procesu zpracování bude záviset na typu a rozměrech největších a nejmenších vzorků, konkrétního použitého tkáňového procesoru, zvolených rozpouštědel, teplot rozpouštědel a dalších faktorů. Následující příklad je založen na šestihodinovém programu, který je vhodný pro použití v rychlém tkáňovém procesoru Leica Peloris™.

Dehydratace

Protože roztavený parafínový vosk je hydrofobní (nemísitelný s vodou), musí být většina vody ze vzorku odstraněna, než může být infiltrována parafínovým voskem. Tento proces se obvykle provádí ponořením vzorků do řady roztoků ethanolu (alkoholu) se zvyšující se koncentrací, dokud se nedosáhne čistého, bezvodého alkoholu. Ethanol je mísitelný s vodou ve všech poměrech, takže voda ve vzorku je postupně nahrazena alkoholem. Běžně se v tomto případě využívá řada postupně se zvyšujících koncentrací alkoholu.

Typická dehydratační sekvence pro vzorky o tloušťce max. 4 mm by byla:

70% ethanol 15 min

90% ethanol 15 min

100% ethanol 15 min

100% ethanol 15 min

100% ethanol 30 min

100% ethanol 45 min

Po tomto procesu by měla být ze vzorku odstraněna veškerá drobná rezidua pevně vázané (molekulární) vody.

Čištění

Bohužel, ačkoli je tkáň nyní v podstatě bez vody, stále ji nemůžeme infiltrovat voskem, protože vosk a ethanol jsou do značné míry nemísitelné. Proto musíme použít mezikrokové rozpouštědlo, které je plně mísitelné s ethanolem i s parafínovým voskem. Toto rozpouštědlo nahradí ethanol ve tkáni, a potom se toto rozpouštědlo (xylen) nahradí roztaveným parafínovým voskem. Tato fáze procesu se nazývá „čištění“ a použité činidlo se nazývá „čistící reagencie“. Termín „čištění“ byl zvolen proto, že mnoho (ale ne všechna) čistících činidel dodává tkáni optickou čirost nebo průhlednost díky jejich relativně vysokému indexu lomu. Další důležitou úlohou čistícího činidla je odstranění podstatného množství tuku z tkáně, které obvykle představuje bariéru proti infiltraci voskem.

Oblíbeným čistícím prostředkem je xylen. Pro úplné vytlačení ethanolu je zapotřebí více čistících kroků.

Typická čistící sekvence pro vzorky o tloušťce max. 4 mm by byla:

xylen 20 min

xylen 20 min

xylen 45 min

Infiltrace voskem

Tkáň může být nyní infiltrována vhodným histologickým voskem. Přestože byla v průběhu mnoha let hodnocena a používána spousta různých činidel, nejpopulárnější jsou histologické vosky na bázi parafínového vosku. Typický vosk je kapalný při 60° C a může být infiltrován do tkáně při této teplotě a poté ponechán  aby vychladnul na 20° C. Při této teplotě ztuhne na konzistenci, která umožňuje důsledné řezání řezů v mikrotomu. Tyto vosky jsou směsi čištěného parafínového vosku a různých přísad, které mohou zahrnovat pryskyřice, jako je styren nebo polyethylen. Mělo by být zmíněno, že tyto voskové přípravky mají velmi zvláštní fyzikální vlastnosti, které umožňují rozřezat tkáně infiltrované parafínovým voskem i na tloušťku 2 um. Řezy si poté udrží svou pevnost a flexibilitu po celou dobu práce s řezem a mohou být poté dokonale vyrovnány např. na vodní hladině, před vlastním nanesením na podložní sklo.

Typická infiltrační sekvence pro vzorky o tloušťce max. 4 mm by byla:

vosk 30 min

vosk 30 min

vosk 45 min

Vkládání vzorků do bloků a zalévání

Nyní, když je vzorek důkladně infiltrován parafínovým voskem, musí být zformován do „bloku“, který může být následně upnut do mikrotomu. 

Tento krok se nejčastěji provádí pomocí zalévací linky a speciálních formiček. Nejčastěji je kovová formička naplněna roztaveným voskem a do něj je vložen vzorek. Vzorek je ve formičce velmi pečlivě orientován, protože jeho umístění bude určovat „rovinu řezu“, což je důležitý faktor v diagnostické i výzkumné histologii. Plastová kazeta, ve které byl vzorek procesován se umístí na horní část formy, doplní se dalším voskem a celá sestava se umístí na studenou desku, aby ztuhla. Po dokončení může být blok s připojenou kazetou vyjmut z formy a je připraven k mikrotomii.

Je třeba poznamenat, že pokud je zpracování tkáně řádně provedeno, jsou voskové bloky obsahující vzorky tkáně velmi stabilní a představují důležitý zdroj archivního materiálu.

Zpracování „bez xylenu“

Přestože se xylen používá velmi široce jako „čistící“ činidlo pro zpracování tkáně, jedná se o toxické činidlo a některé laboratoře dávají přednost použití méně toxických alternativ, jako je isopropanol nebo jiné xylenové náhražky. Aby byla tato metoda úspěšná, jsou vyžadovány vyšší teploty vosku, aby se izopropanol následně mohl ze vzorků vyloučit během infiltrace.

Vliv zpracování tkáně na vzorky

Kvalitní tkáňové zpracování je rozhodující pro přesnou diagnózu. Kombinované účinky fixace a následného zpracování vzorku mají za následek ztuhnutí tkáně a je nevyhnutelné, že dojde také ke smršťování tkáně. Odhaduje se, že tkáně se smršťují až o 20 % nebo více v době, kdy jsou infiltrovány voskem4. Bez ohledu na tyto účinky budou řezy, připravené z optimálně zpracovaných tkání, trvale vykazovat vynikající morfologický detail, který umožňuje srovnání mezi vzorky a přesné histopatologické diagnózy.

Teoreticky i prakticky budou na následné zpracování krájením nejjednodušší takové parafínové bloky, které obsahují relativně homogenní tkáň a budou rovnoměrné měkké konzistence (jako jsou např. ledviny). Když je taková tkáň infiltrována voskem, má konzistenci podobnou té samotného ztuhlého vosku (neobsahujícího tkáň). 

Tkáně husté nebo vláknité povahy nebo vzorek, ve kterém jsou v diskrétních vrstvách přítomny jak tvrdá, tak měkká tkáň, mohou představovat větší výzvu, protože jejich části nejsou tak dobře podloženy ztuhlým voskem. Diferenciální smrštění různých prvků v těchto blocích během fixace a zpracování přispívá k problémům, které by se mohly vyskytnout při jejich dělení.

Reference

Clayden EC. Practical section cutting and staining. Edinburgh: Churchill Livingstone, 1971.

Hopwood D. Fixation and fixatives. In Bancroft J and Stevens A eds. Theory and practice of histological techniques. New York: Churchill Livingstone, 1996.

Carson FL. Histotechnology. 2nd ed. Chicago: ASCP Press, 2007.

Winsor L. Tissue processing. In Woods A and Ellis R eds. Laboratory histopathology. New York: Churchill Livingstone, 1994;4.2-1 – 4.2-39.

 

 

Jak zjistíme, že bude protilátka vykazovat zkříženou reaktivitu?

Jak zjistíme, že bude protilátka vykazovat zkříženou reaktivitu?

Ke zkřížené reaktivitě dochází tehdy, kdy protilátka připravená proti jednomu konkrétnímu antigenu rozeznává dva antigeny s podobnou regionální strukturou.

více informací
Úvod do digitální patologie

Úvod do digitální patologie

aké máte pocit, že se novému trendu „zkracování“ nelze vyhnout? Jak se digitalizace může dotknout práce lékařů a laborantek? Jak by se dala využít v základním výzkumu tkání či léčiv?

více informací
Seznamte se s kamerou Leica FLEXACAM C1

Seznamte se s kamerou Leica FLEXACAM C1

Nová kamera z dílny Leica Biosystems vám při pořizování, dokumentování a sdílení obrázků ušetří spoustu času a úsilí. Kamera přemění váš mikroskop na samostatnou digitální zobrazovací stanici, ke které není potřeba klasického počítače. Integrovaný software navíc umožňuje ovládání kamery prostřednictvím myši a klávesnice, které lze připojit přímo ke kameře. Dále tento software nabízí intuitivní anotace, overlay a síťové nástroje pro více flexibility při vylepšování vaší dokumentace.

více informací