Technický přehled o teplem indukovaném zpřístupňování epitopů

kategorie: imunohistochemie
vytvořeno: 27.4.2021

Autor: Russell Myers, Ph.D.

 

Během posledních pětadvaceti let imunohistochemie (IHC) pokročila od techniky omezené pouze pro specializované laboratoře se silným výzkumným zázemím k technice, která se běžně používá ve většině patologických laboratořích. Ve skutečnosti se IHC stala neocenitelnou technikou v diagnostické patologické laboratoři. Hodnota IHC je dána schopností tohoto procesu rozpoznávat a lokalizovat specifické proteiny (markery) ve vzorku tkáně. Stanovením přítomnosti nebo nepřítomnosti specifických markerů v nádoru jsou patologovi poskytnuta vodítka, která mohou pomoci při přesné klasifikaci nebo identifikaci novotvaru.

 

Úvod

Hodnota nebo síla IHC je často ovlivněna fixací a zpracováním tkáně. Zatímco fixační prostředky na bázi formalínu mohou zajistit vynikající uchování morfologie, cytologie a tkáňové struktury, fixace formalínem výrazně snižuje citlivost IHC techniky. Formaldehyd se kovalentně váže na tkáňový protein, a také způsobuje zesíťování sousedících proteinů nebo peptidů za formování velkých proteinových agregátů. Předpokládá se, že zesíťování proteinů a peptidů s antigenem blokuje nebo „maskuje“ epitop, a tím brání vazbě protilátky.

Teplem indukované zpřístupnění, nebo též odmaskování epitopů (Heat induced epitope retrieval – HIER) může být definováno nejjednoduššími termíny jako použití tepla ve spojení se specifickými pufrovanými roztoky k obnovení reaktivity antigenu ve tkáni zalité do parafínu a fixované formalínem. Postup HIER měl obrovský dopad na způsob, jakým je IHC využívána v diagnostickém procesu. Mnoho markerů, které jsou nyní rutinně analyzovány pomocí IHC ve tkáni fixované formalínem, nemohlo být před 15 až 20 lety tímto způsobem vůbec vyhodnoceno.

 

Mechanismus HIER

I když mechanismy, kterými působí HIER, nejsou jasné, většina souhlasí s tím, že postup nějakým způsobem změní chemickou modifikaci antigenu zprostředkovanou formaldehydem. Existuje celá řada teorií, jak k tomu může docházet. Nejpřednější z těchto teorií je přesvědčení, že tepelná energie procesu HIER rozbije příčné vazby, které váží okolní proteiny nebo peptidy k antigenu. V tomto scénáři HIER působí tak, že „odmaskuje“ nebo otevře epitop. V jiné teorii se předpokládá, že HIER slouží k odstranění vázaných ionů vápníku z míst zesíťování. Tato teorie je podporována faktem, že několik HIER pufrů, jako citrát a EDTA, fungují jako chelátory vápníku.

 

Zdroje tepla

Pro HIER byly úspěšně použity různé zdroje ohřevu, včetně mikrovlnné trouby, napařovače zeleniny, tlakového hrnce a vodní lázně. Teplota dosažená tepelnými zdroji je kritickým faktorem v procesu HIER. Obecně platí, že čím vyšší je teplota HIER roztoku, tím efektivnější je obnovení epitopu.

Napařovací hrnec, vodní lázeň a mikrovlnná trouba produkují teploty v rozmezí 94 °C až 100 °C. Tlakové hrnce jsou schopné vytvořit teploty 110-120 °C. Rozdíly mezi teplotami dosaženými těmito zdroji lze kompenzovat úpravou doby ohřevu. Čím nižší je teplota, tím delší čas vystavení teplu je potřeba k vytvoření stejné intenzity mikroskopického zbarvení pozorované při vyšší teplotě. Vhodná úprava doby ohřevu k vyrovnání maximálních teplotních rozdílů tak umožňuje použití jakéhokoliv z uvedených zdrojů tepla k dosažení srovnatelné intenzity zbarvení.

I když je každý z ohřívacích zdrojů pro HIER vhodný, existují výhody a nevýhody s každým zdrojem spojené (Tabulka 1). Mikrovlnná trouba, která byla prvním široce využívaným zdrojem tepla pro HIER, je v dnešní době zřejmě nejméně používaným tepelným zdrojem. Rozdělení tepla v mikrovlnné troubě je často nerovnoměrné nebo nekonzistentní. Nerovnoměrné zahřívání vede k nedostatečné reprodukovatelnosti s ohledem na intenzitu barvení. Další nevýhodou použití mikrovlnné trouby je prudký var, který se často vyskytuje u tohoto zdroje tepla. Promíchávání vroucího HIER roztoku může vést k oddělení tkáně od sklíček.

Na rozdíl od mikrovlnné trouby, tlakový hrnec, napařovací hrnec a vodní lázeň způsobují rovnoměrné a konzistentní rozložení tepla. Vyšší teploty způsobené tlakovým hrncem jsou výhodné v tom, že v krátké době lze dosáhnout obnovení reaktivity epitopu, nicméně vyšší teplota může poškodit nebo pokřivit morfologii. Po použití tlakového hrnce může pojivová tkáň vypadat jako rozdrcená nebo spálená.

Tabulka 1: Porovnání tepelných zdrojů

Tepelný zdroj Výhody Nevýhody
Mikrovlnná trouba ●      Levná

      Snadné použití

      Rychlé dosažení teploty

●      Nerovnoměrné rozdělení tepla

      Agresivní varný účinek

      Ztráta tkáně

      Odpařování pufru

Napařovač na zeleninu       Levný

●      Snadné použití

      Rovnoměrné rozdělení tepla

      Dobrá morfologie tkáně

●      Vyžaduje víc času na ohřev než mikrovlnná trouba nebo tlakový hrnec
Vodní lázeň       Snadné použití

●      Rovnoměrné rozdělení tepla

●      Dobrá morfologie tkáně

      Drahá

●      Vyžaduje víc času na ohřev než mikrovlnná trouba nebo tlakový hrnec

Tlakový hrnec       Rovnoměrné rozdělení tepla

●      Vysoká teplota

●      Vyšší citlivost IHC

●      Vyžaduje krátkou dobu ohřevu

●      Drahý

●      Vznik artefaktů a poškození tkáně v důsledku vysoké teploty

 

Odmaskovací pufry

Od vývoje HIER bylo využíváno široké spektrum pufračních roztoků. V současné době lze HIER roztoky rozdělit do tří skupin podle pH a složení pufru:

  1. Roztoky o nízkém pH (pH ~ 3-5), často pufrované glycin-HCl.
  2. Roztoky o nízkém až neutrálním pH (pH ~ 6-7) pufrované kyselinou citronovou.
  3. Roztoky s vysokým pH (pH ~ 8-10) pufrované Tris nebo EDTA.

Současná zjištění ukazují, že pH HIER roztoků je důležitější než složení pufru. Optimální obnovení většiny epitopů nastává v alkalických pufrech o pH 8-10. EDTA pufry jsou účinné zejména pro nadměrně fixované vzorky a pro obnovení těžko detekovatelných antigenů. Pufry o vysokém pH a na bázi EDTA nejsou bez nedostatků. Roztoky o vysokém pH pravděpodobně způsobují poškození řezů na mikroskopických sklíčkách. Kromě toho mohou roztoky EDTA vést k pokřivení morfologie, stejně tak i ke spletitým a bizarním tvarům jader. V této době neexistuje žádný „univerzální“ pufr pro HIER, který by byl optimální pro všechny antigeny. Každá laboratoř by měla vyhodnotit účinnost různých HIER roztoků na obnovení širokého spektra antigenů běžně vyhodnocovaných v laboratoři. Běžným přístupem je pro většinu antigenů použití pufru, jako je citrát. Roztok o vysokém pH nebo na bázi EDTA může být vyhrazen pro ty antigeny, které je obtížně zpřístupnit pomocí citrátu.

 

Role laboratorního personálu

Z výše popsaného je patrné, že technika HIER poskytuje laborantovi nebo patologovi ohromující možnosti výběru co se týče zdrojů tepla a pufrů. Konečná rozhodnutí by pak měla být přijata po zralé úvaze v kontextu výkonnostních kritérií nebo očekávání stanovených laboratoří.

 

(Převzato ze zahraničního zdroje, redakčně upraveno.)

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací