Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

vytvořeno: 23.2.2022

(Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

 

Autor: Matthew Mahavongtrakul, PhD

 

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Jedním ze zdrojů takového pozadí je autofluorescence způsobená strukturálními složkami tkáně, např. kolagenem a elastinem nebo červenými krvinkami, případně fixací aldehydy. Výsledkem je rozsáhlá emise napříč celou tkání a zastření specifického zabarvení antigenu. Tento problém může narušovat specifické zabarvení cíle, vést k falešně pozitivním výsledkům, působit potíže s validací testu a zpochybňovat věrohodnost dat, proto je povědomí o něm zcela zásadní.

Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení.

 

Co je autofluorescence?

Autofluorescence je fluorescence pozadí způsobená přirozeně se vyskytujícími látkami, která může ve vašem vzorku ovlivnit poměr signálu k šumu. K jejímu vzniku mohou vést některé metody fixace tkáně, zejména pokud používáte fixativa na bázi aldehydů, jako jsou formalín či glutaraldehyd. Jejím zdrojem může být i samotná tkáň. Potenciálním zdrojem autofluorescence mohou být například červené krvinky, kolagen či elastin. Dalším zdrojem je lipofuscin, který vzniká nahromaděním proteinů a lipidů a typicky jej lze nalézt ve stárnoucích tkáních mozku a míchy. Dokonce i činidla na inkoustové bázi, která dokážou účinně snižovat červenou či zelenou autofluorescenci v lipofuscinech, mohou vyvolávat autofluorescenci na nejvzdálenějším červeném konci spektra. Pokud se tedy autofluorescence může projevit v kterékoli části spektra, jak zjistíme, že se jedná právě o ni?

Jednoduchá odpověď zní, že pokud zapnete laser a uvidíte téměř jednolitý neočekávaný „signál“ v celé tkáni, který se může zobrazovat konzistentně na různých kanálech, pak by mohlo jít o autofluorescenci. Problém s autofluorescencí může přetrvávat dokonce i při zkrácení expozice, zejména v případě slabého cílového signálu. Prvním krokem k řešení může být zvýšení koncentrace buď primární nebo sekundární protilátky (případně obou!), v některých případech však může být výsledkem pouze zvýšení pozadí.

 

Jakými způsoby lze autofluorescenci snížit?

Typickým činidlem používaným v některých případech ke snížení autofluorescence jsou barviva. Jak už jsme uvedli výše, činidla na inkoustové bázi, jako je např. hydrofobní barvivo Sudan Black B, mohou navázáním na tkáň a snížením fluorescence snižovat autofluorescenci v červeném a zeleném kanálu. Barvivo Sudan Black B však nedokáže snížit autofluorescenci způsobenou fixací aldehydy nebo tkáňovými elementy, jako jsou krvinky či kolagen. Obdobně další chemické látky, jako např. síran měďnatý nebo tetrahydridoboritan sodný, v některých případech s různým úspěchem vedou ke snížení autofluorescence, zatímco v jiných případech nikoli. Proč plýtvat drahocennou tkání i časem na málo účinné metody snižování autofluorescence, když můžete dosáhnout správného imunofluorescenčního barvení konzistentním způsobem?

 

Dva snímky výše: Preparáty z lidské sleziny (FFPE) zabarvené k použití myších anti-CD20 (červená) a králičích anti-Ki67 (zelená) primárních protilátek detekovaných pomocí sady VectaFluor Duet kit (DK-8818). Povšimněte si významného potlačení autofluorescence na ošetřeném řezu (nahoře) při zachování dobře ohraničeného specifického signálu jak červeného, tak zeleného kanálu.

 

Jak dát vale autofluorescenci?

Snímky: Sériové řezy z lidské prostaty (FFPE) zabarvené k vykreslení epitelu (červená) kontrastním barvivem DAPI (modrá). Povšimněte si zcela chybějící fluorescence červených krvinek a zachování specifického zabarvení epitelu na řezu ošetřeném přípravkem TrueVIEW.

 

Vector Laboratories nabízí soupravy pro zhášení autofluorescence TrueVIEW® Autofluorescence Quenching Kits, které dokážou podstatně snížit autofluorescenci, jež nepochází z lipofuscinů, ale z tkáňových elementů, červených krvinek nebo fixačních přípravků na bázi aldehydů. Hydrofilní nefluorescenční molekuly v soupravě se elektrostaticky vážou na kolagen, červené krvinky a elastin, a rovněž na tkáň fixovanou aldehydem, čímž významně snižují autofluorescenci. Ošetření touto soupravou na konci imunofluorescenčního protokolu zabere pouze pět minut, navíc při pokojové teplotě, přičemž je souprava kompatibilní s řadou běžných fluoroforů, jako např. GFP, AlexaFluor®, FITC, DyLight® a kyaniny. Uvádí účinnost dokonce i v tak problematických tkáních, jako jsou ledviny, slezina či slinivka.

Součástí soupravy je také montovací médium s ochranou proti vyblednutí („anti-fade“) s možností případného použití kontrastního barviva DAPI. Tento třístupňový protokol vyžaduje pouze smíchání všech tří reagencií v poměru 1 : 1 : 1, aplikaci vzniklého roztoku na tkáň, překrytí krycím sklíčkem a vizualizaci. Nyní můžete prodloužit expozici, čímž dosáhnete vysoké intenzity zabarvení zájmového cíle a snímku, který bude hoden stát se vaší profilovou fotografií na LinkedIn.

 

(Převzato ze zahraničního zdroje, redakčně upraveno.)

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Jak specificky zacílit: blokátory v imunohistochemii

Jak specificky zacílit: blokátory v imunohistochemii

Za ideálních okolností není na povídání si s kamarádkou nic obtížného ani složitého. Ale v intenzivním prostředí, jako je třeba hlučný večírek, do bezprostřední komunikace často vstupují konkurenční zvuky, které vaši řeč přehluší nebo zhorší její srozumitelnost. K předání sdělení pak musíte nalézt způsob, jak hluk na pozadí překonat. Vědci, kteří provádějí testy založené na detekci protilátek, jako jsou IHC metody, a na závěr složitého barvicího protokolu analyzují výsledky, se potýkají s podobným problémem. Aby dokázali určit, zda vidí skutečný výsledek, potřebují odblokovat externí „šumy“ a zaměřit se na specifický signál.

více informací
kategorie: imunohistochemie