Autor: Matthew Mahavongtrakul, PhD
Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Jedním ze zdrojů takového pozadí je autofluorescence způsobená strukturálními složkami tkáně, např. kolagenem a elastinem nebo červenými krvinkami, případně fixací aldehydy. Výsledkem je rozsáhlá emise napříč celou tkání a zastření specifického zabarvení antigenu. Tento problém může narušovat specifické zabarvení cíle, vést k falešně pozitivním výsledkům, působit potíže s validací testu a zpochybňovat věrohodnost dat, proto je povědomí o něm zcela zásadní.
Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení.
Co je autofluorescence?
Autofluorescence je fluorescence pozadí způsobená přirozeně se vyskytujícími látkami, která může ve vašem vzorku ovlivnit poměr signálu k šumu. K jejímu vzniku mohou vést některé metody fixace tkáně, zejména pokud používáte fixativa na bázi aldehydů, jako jsou formalín či glutaraldehyd. Jejím zdrojem může být i samotná tkáň. Potenciálním zdrojem autofluorescence mohou být například červené krvinky, kolagen či elastin. Dalším zdrojem je lipofuscin, který vzniká nahromaděním proteinů a lipidů a typicky jej lze nalézt ve stárnoucích tkáních mozku a míchy. Dokonce i činidla na inkoustové bázi, která dokážou účinně snižovat červenou či zelenou autofluorescenci v lipofuscinech, mohou vyvolávat autofluorescenci na nejvzdálenějším červeném konci spektra. Pokud se tedy autofluorescence může projevit v kterékoli části spektra, jak zjistíme, že se jedná právě o ni?
Jednoduchá odpověď zní, že pokud zapnete laser a uvidíte téměř jednolitý neočekávaný „signál“ v celé tkáni, který se může zobrazovat konzistentně na různých kanálech, pak by mohlo jít o autofluorescenci. Problém s autofluorescencí může přetrvávat dokonce i při zkrácení expozice, zejména v případě slabého cílového signálu. Prvním krokem k řešení může být zvýšení koncentrace buď primární nebo sekundární protilátky (případně obou!), v některých případech však může být výsledkem pouze zvýšení pozadí.
Jakými způsoby lze autofluorescenci snížit?
Typickým činidlem používaným v některých případech ke snížení autofluorescence jsou barviva. Jak už jsme uvedli výše, činidla na inkoustové bázi, jako je např. hydrofobní barvivo Sudan Black B, mohou navázáním na tkáň a snížením fluorescence snižovat autofluorescenci v červeném a zeleném kanálu. Barvivo Sudan Black B však nedokáže snížit autofluorescenci způsobenou fixací aldehydy nebo tkáňovými elementy, jako jsou krvinky či kolagen. Obdobně další chemické látky, jako např. síran měďnatý nebo tetrahydridoboritan sodný, v některých případech s různým úspěchem vedou ke snížení autofluorescence, zatímco v jiných případech nikoli. Proč plýtvat drahocennou tkání i časem na málo účinné metody snižování autofluorescence, když můžete dosáhnout správného imunofluorescenčního barvení konzistentním způsobem?
Dva snímky výše: Preparáty z lidské sleziny (FFPE) zabarvené k použití myších anti-CD20 (červená) a králičích anti-Ki67 (zelená) primárních protilátek detekovaných pomocí sady VectaFluor Duet kit (DK-8818). Povšimněte si významného potlačení autofluorescence na ošetřeném řezu (nahoře) při zachování dobře ohraničeného specifického signálu jak červeného, tak zeleného kanálu.
Jak dát vale autofluorescenci?
Snímky: Sériové řezy z lidské prostaty (FFPE) zabarvené k vykreslení epitelu (červená) kontrastním barvivem DAPI (modrá). Povšimněte si zcela chybějící fluorescence červených krvinek a zachování specifického zabarvení epitelu na řezu ošetřeném přípravkem TrueVIEW.
Vector Laboratories nabízí soupravy pro zhášení autofluorescence TrueVIEW® Autofluorescence Quenching Kits, které dokážou podstatně snížit autofluorescenci, jež nepochází z lipofuscinů, ale z tkáňových elementů, červených krvinek nebo fixačních přípravků na bázi aldehydů. Hydrofilní nefluorescenční molekuly v soupravě se elektrostaticky vážou na kolagen, červené krvinky a elastin, a rovněž na tkáň fixovanou aldehydem, čímž významně snižují autofluorescenci. Ošetření touto soupravou na konci imunofluorescenčního protokolu zabere pouze pět minut, navíc při pokojové teplotě, přičemž je souprava kompatibilní s řadou běžných fluoroforů, jako např. GFP, AlexaFluor®, FITC, DyLight® a kyaniny. Uvádí účinnost dokonce i v tak problematických tkáních, jako jsou ledviny, slezina či slinivka.
Součástí soupravy je také montovací médium s ochranou proti vyblednutí („anti-fade“) s možností případného použití kontrastního barviva DAPI. Tento třístupňový protokol vyžaduje pouze smíchání všech tří reagencií v poměru 1 : 1 : 1, aplikaci vzniklého roztoku na tkáň, překrytí krycím sklíčkem a vizualizaci. Nyní můžete prodloužit expozici, čímž dosáhnete vysoké intenzity zabarvení zájmového cíle a snímku, který bude hoden stát se vaší profilovou fotografií na LinkedIn.
(Převzato od společnosti Vector Laboratories, redakčně upraveno.)