Průvodce řešením problémů – Western blot

kategorie: imunologie
vytvořeno: 17.10.2019

Průvodce řešením problémů – Western blot

Imunochemické metody, které využívají protilátky k analytickému stanovení proteinů, mají velké využití v klinické diagnostice i ve vývoji léků. Mezi již tradiční metody patří zejména Western blotELISA a RIA. V tomto příspěvku s vámi chceme sdílet „troubleshooting“ pro Western blot. Věříme, že bude představovat určitou první pomoc v případě, kdy experimenty nevychází tak jak mají.

Problém

Možný zdroj

Návrh

Slabé / Žádné barvení Zpracování vzorku Zvyšte množství proteinu ve vzorku.
Potvrďte alternativní metodou, že je protein ve vzorku přítomen.
Elektroforéza probíhala příliš dlouho Zkraťte dobu elektroforézy a postup barviva kontrolujte pohledem na přední stranu gelu.

Vypněte proud, když je přední část barviva blízko spodní části gelu.

Staré nebo degradované
proteinové vzorky
Testujte nový vzorek cílového proteinu.
Protein vystoupil z membrány / protein nebyl přenesen správně Použijte membránu s menší velikostí pórů.
Snižte napětí pro proteiny s nižší molekulovou hmotností (méně než 10 kDa). Ujistěte se, že je membrána předem ekvilibrovaná dle pokynů výrobce.
Zkontrolujte a optimalizujte čas přenosu, protože vhodný čas přenosu se liší s MW cílového proteinu.
Ujistěte se, že je blotovací kazeta správně sestavena a že mezi gelem a membránou je dostatečný kontakt. (Informace o správném složení blotovací kazety naleznete v protokolu na Western blot.)
Ujistěte se, že je používán správný přenosový (transferový) pufr.
Přítomnost SDS během přenosu může snížit vazbu proteinu při použití nitrocelulózové membrány.
Přidejte 20 % methanolu do transferového pufru pro zvýšení vaznosti.
Zkontrolujte přenos proteinu obarvením membrány reverzibilním barvivem, jako je Ponceau S, a vizualizujte tak hlavní proužky.
Protein má pl větší než 9 Vyměňte pfur za pufr s vyšším pH (např. CAPS pufr, pH 10,5).
Protein překryty z
blokovacím pufrem
Otestujte jiný blokovací pufr.
Optimalizujte koncentraci proteinu v blokovacím pufru. Doporučujeme 3% odtučněné sušené mléko v deH2O.
Přítomnost enzymových inhibitorů
(např. azid)
Ujistěte se, že pufry neobsahují azid sodný, protože by interferoval s HRP signálem.
Stará nebo degradovaná primární protilátka Zkontrolujte doporučení výrobce ohledně skladovacích podmínek a / nebo expirace. Pokud vypršela expirační lhůta nebo uplynula doba skladování, zakupte si novou protilátku.
Pokud byla protilátka opakovaně zamražena a rozmražena, zakupte novou protilátku, protože může být ovlivněna struktura a schopnost vazby protein: protilátka.
Proveďte Dot Blot, abyste se ujistili, že je protilátka stále aktivní.
Nedostatečné množství primární a / nebo sekundární protilátky Zkontrolujte doporučení výrobce ohledně koncentrace protilátek.
Otestujte více koncentrací, abyste nalezli optimální podmínky pro váš experiment.
Nesprávná primární protilátka Zajistěte, aby primární protilátka reagovala s cílovým proteinem ze studovaného organismu (např. Králičí anti-lidský
VEGF -> lidský VEGF).
Nesprávná sekundární protilátka Ujistěte se, že použitá sekundární protilátka je proti organismu primární protilátky (např. Oslí anti-králík
IgG -> Králičí anti-lidský VEGF).
Nedostatečná inkubace s primární protilátkou Inkubace s protilátkou by měla trvat alespoň 1 hodinu při laboratorní teplotě nebo přes noc při 4 ° C.
Nedostatečná inkubace se sekundární protilátkou Prodlužte inkubační dobu se sekundární protilátkou (informace o inkubační době a teplotě naleznete v doporučeních výrobce).
Membrána je vymyta Zkraťte dobu promývání a / nebo snižte počet promytí.
Použijte promývací pufr, který neobsahuje detergent nebo má nižší koncentraci detergentu.
Nekompatibilní vyvíjecí činidlo Ujistěte se, že použité vývíjecé činidlo je kompatibilní s enzymovým konjugátem.
Zajistěte, aby byl substrát správně připraven dle pokynů výrobce.
Nadbytek soli Snižte množství soli přítomné v promývacím pufru.
Snižte množství soli v pufru pro ředění protilátek.
Degradované / nesprávné
vyvíjecí činidlo
Ujistěte se, že vyvíjecí činidlo bylo připraveno správně.
Zkontrolujte, zda je činidlo stále aktivní. Pokud ne, zakupte nové činidlo.
Pro metodu ECL je špatný film / expirovaný Ujistěte se, že film není expirovaný nebo exponovaný. Pokud ano, zakupte nový vilm.
Pro ECL metodu jsou ECL vyvíjecí roztoky staré / expirované Používejte čerstvé vyvíjecí ECL roztoky.
U metody ECL je doba expozice filmu příliš krátká Zvyšte expoziční čas filmu.
U metody ECL je reakce rušena fólií Použijte jiný typ folie.
Vysoké Pozadí Příliš vysoká koncentrace protilátky Zkontrolujte doporučení výrobce ohledně koncentrace primárních a / nebo sekundárních protilátek.
Otestujte různé koncentrace, abyste našli optimální podmínky pro váš experiment.
Příliš dlouhá inkubace s protilátkou Zkontrolujte protokol výrobce a ujistěte se, že je použita správná doba inkubace a teplota. Pokud výrobce tyto informace neposkytl, optimalizujte inkubační dobu.
Nespecifická vazba protilátek Zajistěte, aby primární protilátka byla specifická pouze pro cílený protein.
Proveďte kontrolu tak, že necháte membránu inkubovat bez primární protilátky. Pokud se vyvinou proužky, vyberte jinou sekundární protilátku.
Vyberte sekundární protilátku z jiného organismu.
Křížová reakce protilátek s proteiny v blokujícím pufru a / nebo vzorku Použijte jiné složení blokovacího pufru.
Kozí protilátky budou reagovat s BSA kvůli mírnému rozpoznání hovězího proteinu kozí protilátkou. Toto povede k fialovému lesku na vaší membráně. Pokud k tomu dojde, použijte protilátku z jiného druhu nebo jiný blokovací pufr.
Pokud podezíráte z problému sekundární protilátku, řeďte ji v pufru s obsahem 1-5 % normálního séra ze stejného organismu jako je cílový protein.
Neefektivní blokovací pufr Použijte jiné složení blokovacího pufru.
Do blokovacího pufru, například TWEEN-20, přidejte detergent.
Nedostatečné blokování Použijte jiné složení blokovacího pufru.
Šarže blokovacího pufru může být neaktivní. Použijte nový blokovací pufr.
Pokud blokujete přes noc při 4 ° C, může dojít ke snížení účinnosti blokace vlivem nižší teploty. Zkuste inkubovat jednu hodinu při pokojové teplotě.
Do blokovacího pufru přidejte TWEEN-20.
Optimalizujte dobu a / nebo teplotu inkubace s blokovacím pufrem.
nedostatečné promytí Po každém kroku promyjte membránu 3krát po dobu 10 minut. Pokud to není dostatečné, zvyšte dobu promytí.
Vyzkoušejte jiný detergent v promývacím pufru nebo přidejte TWEEN-20, pokud ještě není přítomen.
Zvyšte objem použitého promývacího pufru.
Příliš dlouhá inkubace v barvícím substrátu Zkraťte dobu inkubace v barvícím roztoku. Sledujte vývoj, dokud se neobjeví proužky a zastavte reakci promytím membrány v deH20.
Přebytek enzymu Snižte koncentraci vybraného enzymového konjugátu.
Interference způsobená přítomností endogenních enzymů Sušené mléko bez tuku obsahuje endogenní biotin a může interferovat se systémem detekce avidinu / biotinu. Použijte odlišný blokovací pufr, například 3% BSA.
Kontaminovaná činidla Pufry před použitím přefiltrujte za účelem odstranění kontaminant. Připravte si čerství roztoky a opakujte western blot.
Problémy s membránou Testujte nové membrány.
Během celé procedury může být membrána usušena pouze mezi přenosem a imunobarvením. Jakmile je zahájeno imunobarvení membrány, nemůže být membrána usušena, dokud není dokončeno imunobarvení. Pokud došlo k vysušení membrány během imunobarvení opakujte western blot.
U metody ECL je ECL film přeexponován Zkraťte dobu expozice filmu.
Pokud je signál z cílového proteinu příliš silný, počkejte 5-10 minut a znovu exponujte.
Skvrny na pozadí Nerovnoměrné míchání během inkubace Zajistěte, aby byla membrána během inkubace rovnoměrně třepána umístěním na kývačce nebo třepačce.
Nedostatečné množství inkubačního pufru Zajistěte, aby bylo během každé inkubační periody přítomno dostatečné množství roztoku k úplnému ponoření membrány a aby membrána v roztoku volně plavala.
Přítomnost vzduchových bublin během přenosu Před zahájením blotu jemně odstraňte všechny vzduchové bubliny mezi jednotlivými vrstvami blotovací kazety. Můžete použít čistou skleněnou tyčinku nebo zkumavku.
Problémy s mebránou Zajistěte, aby byla membrána důkladně navlhčena podle protokolu výrobce.
S membránami zacházejte velmi opatrně. Nesprávné membrány mohou způsobit nespecifickou vazbu.
Manipulace s membránami holýma rukama může vést ke kontaminaci membrány. Při manipulaci s membránou používejte pinzetu a rukavice.
Agregace HRP konjugátu Pokud používáte HRP, přefiltrujte konjugát, abyste odstranili HRP agregáty.
Použijte čerstvý HRP konjugát.
Kontaminace reagencií Pufry před použitím přefiltrujte pro odstranění kontaminant.

Připravte čerstvé pufry a western blot zopakujte.

Nespecifické proužky Příliš vysoká koncentrace protilátky Zkontrolujte doporučení výrobce pro koncentrace primárních a / nebo sekundárních protilátek.

Otestujte více koncentrací, abyste nalezli optimální podmínky pro váš experiment.

Stará nebo degradovaná protilátka Zkontrolujte doporučení výrobce ohledně skladovacích podmínek a / nebo expirace. Pokud vypršela expirační lhůta nebo uplynula doba skladování, zakupte si novou protilátku.
Pokud byla protilátka opakovaně zamražena a rozmražena, zakupte novou protilátku, protože může být ovlivněna struktura a schopnost vazby protein: protilátka.
Nespecifická vazba primární protilátky Snižte koncentraci primární protilátky.
Zkontrolujte koncentrace proteinu dávaného do gelu.
Použijte specifičtější protilátku, jako je monoklonální protilátka nebo afinitně purifikovanou polyklonální protilátku.
Do roztoku primární protilátky a / nebo blotovacího pufru přidejte malé množství detergentu, jako je TWEEN-20 (0,1-0,5%).
Zvyšte počet / dobu promytí.
Nespecifická vazba sekundární protilátky Snižte koncentraci sekundární protilátky.
Proveďte kontrolu tak, že necháte membránu inkubovat bez primární protilátky. Pokud se vyvinou proužky, vyberte jinou sekundární protilátku.K roztoku sekundární protilátky přidejte malé množství detergentu, jako je TWEEN-20 (0,1-0,5%).
Zvyšte počet / dobu promytí.
Agregace cílového proteinu Přidejte nebo zvyšte koncentraci redukčního činidla, jako je DTT nebo BME, aby se došlo k rozrušení veškerých disulfidových můstků.

Před nanesením na gel zahřejte proteinový vzorek v horké vodní lázni po dobu 5-10 minut.
Zkontrolujte koncentraci proteinu dávaného na gel. Příliš vysoká koncentrace může způsobit agregaci proteinů. Opakujte Western blot s nižší koncentrací proteinů.

Degradace proteinového Připravte čerstvé vzorky a minimalizujte počet cyklů zmražení a rozmražení
vzorků.
Před uskladněním přidejte do vzorků inhibitor proteázy.
Uchovávejte vzorky při teplotě -20 ° C až -80 ° C.
Nedostatečné blokování Otestujte různá složení blokovacího pufru. Šarže blokovacího pufru může být neaktivní. Použijte nový blokovací pufr.

Pokud blokujete přes noc při 4 ° C, může dojít ke snížení účinnosti blokace vlivem nižší teploty. Zkuste inkubovat jednu hodinu při pokojové teplotě.
Do blokovacího pufru přidejte TWEEN-20.
Optimalizujte dobu a / nebo teplotu inkubace s blokovacím pufrem.

SDS způsobuje nespecifickou vazbu
na imobilizované pruhy proteinů
Zajistěte, aby byla membrána po blotu dostatečně promyta.
Nepoužívejte SDS během imunobarvení, pokud používáte nitrocelulózovou membránu.
Přebytek enzymu Snižte koncentraci vybraného enzymového konjugátu.
Kontaminace reagencií Pufry před použitím přefiltrujte pro odstranění kontaminant.

Připravte čerstvé pufry a Western blot zopakujte.

Rozpité / Neostré proužky Příliš vysoká koncentrace protilátky Zkontrolujte doporučení výrobce ohledně koncentrace primárních a / nebo sekundárních protilátek.
Otestujte různé koncentrace, abyste našli optimální podmínky pro váš experiment.
Nadbytek proteinu v gelu Vzorky před nanesením na gel zřeďte.
Přehřátí gelu / vysoké napětí Teplo způsobuje ztrátu struktury gelu a snížení rozlišitelnosti pruhů. Ujistěte se, že je blotovací nádoba umístěna v ledové lázni.
Snižte napětí nebo proud používaný během blotování.
Nesprávná příprava membrány Ekvilibrujte membránu ve správném transferovém pufru (viz protokol výrobce membrány). Ujistěte se, že je namočena po doporučenou dobu.
Bílé proužky
(Metoda vizualizace ECL)
Koncentrace protilátky nebo proteinu je příliš vysoká / nadměrná
generovaný signál
Bílé pruhy jsou výsledkem rychlé spotřeby substrátu způsobené přítomností příliš velkého množství konjugátu. To je výsledkem vysokých koncentrací protilátek a / nebo proteinů. Zkontrolujte doporučení výrobce ohledně koncentrace protilátek a / nebo proteinů.

PeproTech

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací