Průvodce řešením problémů – ELISA

kategorie: imunologie
vytvořeno: 20.5.2020

Průvodce řešením problémů – ELISA

Imunochemické metody, které využívají protilátky k analytickému stanovení proteinů, mají velké
využití v klinické diagnostice i ve vývoji léků. Mezi tradiční metody patří zejména Western blot, o
které jsme již psali, ELISA a RIA.

Porovnání všech tří metod jsme před nedávnou dobou publikovali na blogu.

V tomto příspěvku s vámi chceme sdílet “troubleshooting” pro metodu ELISA. Věříme, že poznatky
obsažené v tomto článku vám budou ku pomoci v případech, kdy experimenty nevycházejí tak, jak by
měly.

Prvním krokem při hledání problémů je připravit si čerstvé pufry. Pufry obsahující BSA před použitím
sterilizujte přefiltrováním a ostatní reagencie před použitím vytemperujte na laboratorní teplotu.

ProblémMožný zdrojNávrh řešení
Vysoké pozadí / Vývoj nespecifického zbarveníNespecifická vazba protilátkyUpravte použitý blokovací pufr (např. zaměňte kasein za BSA). Po blokování neprovádějte promývání; desku vyklepněte, osušte a pokračujte k dalšímu kroku.
Deska není dostatečně promytáBěhem každého promývacího kroku se ujistěte, že jsou všechny jamky naplněny pufrem. Také se ujistěte, že promývací zařízení pracuje správně. Mezi jednotlivými kroky promývejte 3 – 5x. Nepřidávejte další promývací krok. Po posledním promytí osušte destičku silným klepnutím na papírovou utěrku, aby se odstranil zbytkový pufr. Ujistěte se, že do promývacího roztoku bylo přidáno správné množství Tweenu (doporučeno 0,01 – 0,1%).
Kontaminované pufryPřipravte si všechny pufry čerstvé (maximálně 7 dní před použitím) a sterilizujte je filtrací.
Inkubační teplota je příliš vysokáInkubuje se při pokojové teplotě (25ºC) v průběhu celého postupu.
Inkubační doba je příliš dlouháZkraťte inkubační čas.
Kontaminace substrátu konjugátem nebo kontaminace slepých vzorků pozitivní kontrolouMezi pipetováním jednotlivých činidel měňte špičky i nádoby na reagencie. V ideálním případě by měl být promývací pufr odsáván, aby v důsledku vyklepnutí nedocházelo ke cross-kontaminaci.
Koncentrace detekční protilátky nebo avidin-HRP je příliš vysokáZkontrolujte výpočty nebo zkuste další ředění.
Substrát byl před použitím vystavený světluSubstrát uchovávejte ve tmě do poslední chvíle před experimentem a jeho aplikací do jamek.
Při odečtu byl použit nesprávný filtrPři použití doporučených desek by měla být vlnová délka 405nm s korekcí vlnové délky 650nm pro ABTS, nebo 450nm s korekcí vlnové délky 620nm pro TMB.
Měření desky ve špatnou dobu vzhledem k vyvíjeníMonitorujte O.D. slepého vzorku a provádějte měření v 5 minutových intervalech.
Slabý / žádný vývoj zbarveníVynechání kroku nebo opomenutí aplikace činidlaZkontrolujte protokol a pečlivě postupujte podle návodu, krok za krokem.
Koncentrace detergentu v promývacím pufru je příliš vysokáOdstraňte nebo snižte koncentraci detergentu (doporučuje se 0,01 – 0,1%).
Příliš promytá deskaSnižte počet promytí mezi kroky, zejména pokud nepoužíváte automatickou nebo poloautomatickou promývací stanici. 1-2 promytí by měla stačit.
Přítomnost enzymového inhibitoru ve vzorkuAzid sodný inhibuje aktivitu peroxidázy.
Špatná délka inkubace nebo teplotaZkontrolujte a dodržujte doporučení protokolu. Během inkubačních kroků umístěte destičku do inkubátoru, aby se předešlo výkyvům teploty (25 °C).
Do jamek byl přidán nesprávný objem substrátuZkontrolujte pipetu; použijte kalibrované pipety.
Byl použit nesprávný systém enzym-substrátZkontrolujte specifikace výrobce:

avidin-HRP + ABTS / streptavidin + TMB.

Neaktivní konjugát nebo substrátOtestujte aktivitu v jiném systému a zkontrolujte datum expirace reagencií.
Nesprávné skladování jednotlivých složekUložte všechny složky podle doporučení v produktovém listu.
Při odečtu byl použit nesprávný filtrPři použití doporučených desek by měla být vlnová délka 405nm s korekcí vlnové délky 650nm pro ABTS, nebo 450nm s korekcí vlnové délky 620nm pro TMB.
Špatná standardní křivkaNesprávná příprava standarduRoztoky standardů připravte znovu dle návodu. Ředění provádějte jen doporučenými ředícími pufry. V případě použití jiných ředících pufrů je potřeba udělat optimalizaci.
Ředění byla provedena příliš brzyReagencie připravte těsně před použitím a okamžitě přidejte do jamek.
Vazebná protilátka se nenavázalaPoužijte destičky vhodné pro ELISA (tj. Corning 9018, 3361, 3366); ne kultivační desky pro buněčné kultury.
Neefektivní promytíUjistěte se, že promývací zařízení pracuje správně (tj. aplikuje shodné objemy do každé jamky). Ujistěte se, že jsou jamky po odsátí prázdné, ale nezapomeňte je opět včas naplnit.
Chyba pipetováníKapaliny vypouštějte z pipety rychle a identickým způsobem po stěně každé jamky. Používejte kalibrované pipety.
Měření desky ve špatnou dobu vzhledem k vyvíjeníObecně lze říci, že spolehlivé standardní křivky jsou u souprav ABTS dostávány, pokud O.D. nepřesahují u slepých vzorků hodnotu 0,2 a u nejvyšší standardní koncentrace 1,2. U TMB by slepé vzorky neměly přesahovat hodnotu 0,15.
Nesprávné skladování jednotlivých složekUložte všechny složky podle doporučení v produktovém listu. Rehydratované/Rozpuštěné reagencie neponechávejte delší dobu při laboratorní teplotě.
Špatná přesnostNedostatečné promíchání činidelPřed pipetováním zajistěte dostatečné promíchání reagencií.
Neefektivní promytíUjistěte se, že promývací zařízení pracuje správně (tj. aplikuje shodné objemy do každé jamky). Ujistěte se, že jsou jamky po odsátí prázdné, ale nezapomeňte je opět včas naplnit.
Chyba pipetováníKapaliny vypouštějte z pipety rychle a identickým způsobem po stěně každé jamky. Používejte kalibrované pipety.
Recyklované materiályMezi inkubačními kroky vyměňujte pipetovací špičky, zásobníky na reagencie a víčka/fólie desek.
Jamky byly poškrábány špičkami pipety nebo mycím zařízenímPři dávkování i aspiraci postupujte opatrně.
Sraženiny ve vzorcíchVialky před použitím zcentrifugujte.
Znečištění jamek či povrchu deskyPřed použitím si jamky prohlédněte a případné odstraňte nečistoty.

Před odečítáním spodní část desky otřete, abyste odstranili veškeré nečistoty nebo otisky prstů.

Změny na okrajíchVypařováníMezi jednotlivými kroky zakrývejte desku fólií nebo víčkem.
Nerovnoměrná teplotaBěhem inkubačních kroků umístěte destičku do inkubátoru, aby se předešlo výkyvům teploty (25 °C).

Desky neskládejte na sebe.

Další zajímavé články o Imunochemických metodách:

Průvodce řešením problémů – Western blot

ELISA, Multiplex array, Western blot a RIA, která metoda je „ta pravá“?

Metoda ELISA, aspekty jednotlivých uspořádání

Jak zjistíme, že bude protilátka vykazovat zkříženou reaktivitu?

Jak zjistíme, že bude protilátka vykazovat zkříženou reaktivitu?

Ke zkřížené reaktivitě dochází tehdy, kdy protilátka připravená proti jednomu konkrétnímu antigenu rozeznává dva antigeny s podobnou regionální strukturou.

více informací
Úvod do digitální patologie

Úvod do digitální patologie

aké máte pocit, že se novému trendu „zkracování“ nelze vyhnout? Jak se digitalizace může dotknout práce lékařů a laborantek? Jak by se dala využít v základním výzkumu tkání či léčiv?

více informací
Seznamte se s kamerou Leica FLEXACAM C1

Seznamte se s kamerou Leica FLEXACAM C1

Nová kamera z dílny Leica Biosystems vám při pořizování, dokumentování a sdílení obrázků ušetří spoustu času a úsilí. Kamera přemění váš mikroskop na samostatnou digitální zobrazovací stanici, ke které není potřeba klasického počítače. Integrovaný software navíc umožňuje ovládání kamery prostřednictvím myši a klávesnice, které lze připojit přímo ke kameře. Dále tento software nabízí intuitivní anotace, overlay a síťové nástroje pro více flexibility při vylepšování vaší dokumentace.

více informací