Autor: Geoffrey Rolls
Spolupracující: Claudia Dorenkamp, Neville Farmer, Jan Minshew, Kerrie Scott‑Dowell, Fiona Tarbet
ÚVOD
Příprava vysoce kvalitních parafínových řezů pro histopatologii vyžaduje určité dovednosti a zkušenosti – jak se ale říká, nikdo učený z nebe nespadl.
Tato brožura byla připravena coby výcviková pomůcka pro nováčky v přípravě na mikrotomii a krájení parafínových řezů, a také jako doškolovací kurz pro zkušenější histology. Pokrývá základní prvky pro nastavení a bezpečný provoz rotačního mikrotomu pro přípravu parafínových řezů. Jsou v ní ilustrovány některé z běžnějších problémů, včetně návrhů jejich řešení.
Mikrotom zobrazený v této příručce je manuální mikrotom RM2235, poskytnuté návrhy a komentáře lze však aplikovat na většinu moderních rotačních mikrotomů. Popis mechanických a bezpečnostních prvků jiných modelů mikrotomu a pokyny k jejich použití naleznete v příručce k příslušnému nástroji.
OBSAH
1. Fixujte vaše vzorky správně
2. Zpracujte tkáň v tkáňovém procesoru správně
3. Zalévejte vaše vzorky opatrně
4. Zvolte vhodné místo pro umístění mikrotomu
5. Využívejte bezpečnostní prvky správně
6. Optimálně nastavte úhel nože nebo žiletky
7. Maximalizujte životnost nože nebo žiletky
8. Před krájením vzorek vhodně zorientujte
9. Zjistěte více o konstrukčních vlastnostech vašeho mikrotomu a o tom, jak je používat
10. Při zkrajování vzorků buďte opatrní
11. Zvažte faktory ovlivňující tloušťku řezu
12. Ujistěte se, že jsou bloky správně nachlazené
13. Naučte se techniku řezání konzistentních, vysoce kvalitních a tenkých řezů
14. Vyberte správná podložní skla
15. Buďte při používání vodní lázně opatrní na vypnutí řezů
16. Provádějte správně následné sušení řezů
17. Zajistěte správnou údržbu mikrotomu
18. Naučte se rozpoznávat a opravovat běžné chyby
1. FIXUJTE VAŠE VZORKY SPRÁVNĚ
Fixace je při zpracování histologického vzorku vůbec nejdůležitějším krokem. Bez ohledu na to, jak moc je věnována pozornost zpracování a krájení vzorků tkáně, základní morfologické podrobnosti budou prokázány pouze, pokud je tkáň rychle a adekvátně zafixována.
● Špatně fixované vzorky jsou téměř vždy složitější pro krájení než ty, které jsou zafixovány dobře.
● Špatně fixovaná tkáň bude vždy produkovat horší morfologii, i když byla optimálně zpracována v dalších krocích.
2. ZPRACUJTE TKÁŇ V TKÁŇOVÉM PROCESORU SPRÁVNĚ
Pokud nebude dobře zafixovaný vzorek řádně zpracován v tkáňovém procesoru podle příslušného protokolu, bude obtížné parafínový blok krájet.
● Vzorky mohou být nedostatečně zpracovány (příliš velký vzorek, příliš krátký protokol) nebo nadměrně zpracovány (příliš dlouhý protokol pro velikost a povahu vzorku). V obou případech může být obtížné nebo nemožné je krájet.
● Existuje mnoho technik, které lze použít pro získání řezů i z nesprávně zpracovaných bloků (viz brožura o obtížně zpracovatelných blocích)
● Pokud je řezy obtížné ukrojit, protože je tkáň tvrdá nebo drobivá, může být exponovaný povrch namočen do studené vody nebo do změkčovacího prostředku, jako je slabý čisticí roztok, aviváž nebo Mollifex.
● U vzorků obsahujících vápník může použití odvápňovacího prostředku naneseného na exponovanou tkáň po dobu 10 minut nebo více umožnit získání několika soudržných řezů. Před nasazením vzorku do držáku mikrotomu a jeho opětovným krájením bloky dobře opláchněte, protože stopy odvápňovacího prostředku přítlačnou desku držáku čepele poškozují.
● Pro získávání řezů ze složitých bloků, kde může být vadná fixace, zpracování nebo infiltrace a normální metody krájení jsou neúspěšné, se doporučuje systém „Paraffin Tape-Transfer“ .
● Pokud není možné získat z dané části bloku vhodné řezy, protože byl vzorek nejprve nedostatečně zpracován v tkáňovém procesoru, je možné jej zpracovat znovu.
(viz brožura o obtížně zpracovatelných blocích)
Tento blok pankreatu neměl dostatečnou fixaci a byl zpracován pomocí příliš krátkého protokolu. Ukazuje typické důsledky nedostatečného zpracování – v okolním parafínu došlo ke značnému zmenšení vzorku. Tkáň byla měkká a kašovitá a nebylo možné ji krájet. Tento vzorek vyžadoval přepracování.
3. ZALÉVEJTE VAŠE VZORKY OPATRNĚ
Zalévání vzorku je další důležitý krok vyžadující promyšlený přístup. Neopatrné zalití může krájení na mikrotomu velmi ztěžovat.
● Vyvarujte se nedostatečného naplnění kazety parafínem. Mohlo by totiž způsobit nestabilní upnutí bloku v mikrotomu a vést k řezání nepravidelných řezů, případně i k dalším problémům.
● Vyvarujte se přeplnění kazet parafínem, mohlo by totiž narušit správné zarovnání bloku pro krájení.
● Veškerý přebytečný parafín na vnější straně kazety by měl být před upnutím odstraněn, aby bylo během krájení zajištěno pevné držení bloku.
● Orientace vzorku je velmi důležitá (viz část 8 – orientace vzorku).
Příklady málo zalitého bloku (vlevo), přelitého bloku (vpravo) a vhodně naplněného bloku parafínem (uprostřed). Nedostatečné nebo přehnané zalití vzorku parafínem způsobuje potíže při dalším zpracování.
4. ZVOLTE VHODNÉ MÍSTO PRO UMÍSTĚNÍ MIKROTOMU
Vhodné umístění mikrotomu v laboratoři je důležité.
● Umístěte mikrotom na stabilní stůl, mimo dosah průvanu, dveří a kolemjdoucích pracovníků. Jakýkoli pohyb vzduchu z klimatizačních zařízení nebo jiné příčiny mohou velmi ztěžovat manipulaci s řezy.
● Pokud je to možné, používejte výškově nastavitelný stůl a ergonomickou pracovní židli.
● Je velmi důležité, aby personál při používání mikrotomu nebyl rozptylován. Je zde totiž riziko poranění extrémně ostrými čepelemi. Při umisťování mikrotomů do laboratoře je třeba vzít v úvahu potenciál interakce s ostatními zaměstnanci.
● Je vhodnější mít v blízkosti mikrotomů protiskluzovou podlahu. Fragmenty parafínu se totiž nevyhnutelně dostanou na podlahu, kde mohou vytvářet kluzký povrch. Aby bylo prostředí bezpečnější, používá mnoho laboratoří protiskluzové rohože.
5. VYUŽÍVEJTE BEZPEČNOSTNÍ PRVKY SPRÁVNĚ
Musíte znát bezpečnostní prvky vašeho mikrotomu, které se při krájení řezů používají a dodržovat některá základní pravidla.
● Mikrotomové nože a čepele na jedno použití jsou extrémně ostré. Pokud nebudete při práci s nimi náležitě opatrní, mohou způsobit vážná zranění. K nehodám dochází především ve chvílích, kdy je pracovník rozptylován a není plně koncentrován.
● Pro zachycení řezů nebo parafínových úlomků z ostří nože nebo z bloku používejte místo prstů pinzetu nebo štětec.
● Rotační mikrotomy jsou vybaveny bezpečnostním krytem (kryt nože nebo chránič prstů), zámkem ručního kola a brzdou ručního kola pro bezpečný provoz.
● Ochranný kryt lze umístit tak, aby pokryl celou délku břitu.
● Zámek ručního kola uzamkne držák vzorku v horní části řezného zdvihu a musí být použit při výměně bloků.
● Ochranný kryt musí být na místě a musí být zajištěn zámek ručního kola, když je do kazetové svorky blok vložen nebo je z něj odstraňován, nebo když je s blokem prováděna jakákoliv manipulace, zatímco je nůž nebo čepel na svém místě. Ochranný kryt musí být také používán, když je mikrotom ponechán bez dozoru.
● Brzda ručního kola uzamkne mikrotom, když je rukojeť v jakékoliv poloze, a používá se při orientování bloku nebo při nastavování hrubého posuvu.
● Při čištění nástroje nebo v případě, že je nástroj ponechán bez dozoru, by se měl z mikrotomu nůž nebo žiletka odstranit. Toho se nejlépe dosáhne uvolněním žiletky a jejím následným vysunutím ze svorky pomocí vyhazovače na levé straně ochranného krytu. Lze ji pak uchopit pinzetou (ne prsty) nebo pomocí magnetu na konci štětce a bezpečně odstranit. Použité žiletky by měly být vhodně zlikvidovány v nádobě na „ostré předměty“ nebo vhozeny do štěrbiny na „použité žiletky“ v základně dávkovače žiletek.
● Nikdy nepokládejte nůž či žiletku na stůl nebo do krabice řeznou hranou nahoru. Pokud vám žiletka upadne, nechte ji spadnout. V žádném případě se ji nepokoušejte chytit – což je přirozená reflexní akce, před kterou se musíte chránit.
V době, kdy se nekrájí, je červený bezpečnostní kryt na RM2235 na tomto ilustračním obrázku umístěn správně. Při správném použití kompletně zakrývá žiletku.
Zde je zobrazen zámek ručního kola, kdy je ruční kolo v poloze 12 hodin a zámek je zajištěn. Tento zámek zapadne do této polohy pouze v horní části řezného zdvihu.
Zde je zobrazena brzda ručního kola u RM2235 v zajištěné poloze. Brzdu lze aktivovat ručním kolem v jakékoliv poloze. Ke znehybnění mikrotomu lze použít zámek ručního kola nebo brzdu ručního kola.
6. OPTIMÁLNĚ NASTAVTE ÚHEL NOŽE NEBO ŽILETKY
Úhel nože (případně žiletky) je nastavitelný. Pro efektivní a správné krájení musí být nastaven optimálně.
● Nastavený úhel držáku nože nebo žiletky ovlivňuje kontakt mezi fazetou nože a vzorkem.
● Úhel fazety je úhel mezi dvěma fazetami, které tvoří břit. Pro běžné použití jsou nože a čepele na jedno použití vyráběny s úhlem fazety přibližně 35°, tento úhel se však může lišit podle typu čepele a také od výrobce k výrobci.
● Proto musí být pro každý typ nože nebo žiletky optimálně nastaven úhel držáku.
● Doporučené nastavení úhlu se řídí pokyny výrobce mikrotomu. U držáků nožů a čepelí společnosti Leica Biosystems se doporučuje nastavení mezi 1° a 5°.
7. MAXIMALIZUJTE ŽIVOTNOST NOŽE NEBO ŽILETKY
Existuje pár jednoduchých strategií, jak u každé čepele dosáhnout maximální životnosti.
● Při čištění nože se nedotýkejte ničeho podél břitu. I celulózová vlákna mohou ostří nože nebo žiletky poškodit.
● Nedotýkejte se ostří tvrdými předměty, jako jsou kleště nebo kartáč.
● Používejte čepel systematicky, pracujte od jednoho konce ke druhému. Získáte tak maximální životnost všech částí čepele.
● Použijte jednu část čepele pro zkrajování vzorku a další novou část pro finální krájení, nebo použijte pro tyto dva postupy samostatné čepele.
● Mikrotom s retrakcí prodlužuje životnost čepele tak, že při pohybu čepele zpět do základní polohy (po ukrojení řezu) oddaluje vzorek od čepele, a tím zabraňuje hromadění nečistot na zadní straně čepele.
8. PŘED KRÁJENÍM VZOREK VHODNĚ ZORIENTUJTE
Správná orientace vzorku a jeho zarovnání na čepel během řezacího zdvihu může ovlivnit snadnost, s jakou lze sériový řez získat, a přímo ovlivnit i kvalitu řezu.
● Ve většině laboratoří jsou všechny kazety (bloky se vzorkem) umisťovány do držáku bloku vždy se stejnou orientací (např. se blok značí štítkem, který je po upnutí vzorku do držáku orientován vždy na stejném místě). Toto se provádí pro usnadnění při zkrajování více bloků před přípravou finálních kvalitních řezů. Tento postup umožňuje získání více řezů ze stejného vzorku, aniž by došlo k nadměrným ztrátám tkáně. Ve fázi upevňování bloku do držáku je proto třeba vzít v úvahu orientaci vzorku na čepel. Tento požadavek je často přehlížen.
● Ilustrace níže ukazuje preferovanou orientaci některých typických vzorků ve vztahu k ostří nože. Názory na to, jaká orientace je nejlepší pro konkrétní typy vzorků, se budou lišit, orientace je však důležitá a je třeba ji brát v potaz.
● Příklad A, střevo: Čepel prochází sliznicí jako poslední.
● Příklad B, cervix: Je lepší, aby čepel jako první narazila na hustou tkáň než na rovnou hranu.
● Příklad C, kůže: Čepel prochází pokožkou jako poslední.
● Některé mikrotomy, jako je například RM2235, mají zařízení pro přesnou orientaci vzorku s kalibrovanými ovládacími prvky, které usnadňují nalezení nulové polohy nebo měřitelné proměnné na ose x / y. Tato vlastnost je velmi užitečná při krájení bloků připravených v jiných laboratořích nebo v jiných mikrotomech, kde je nutné přesné vyrovnání, aby se zabránilo zbytečné ztrátě tkáně. Pro rutinní použití při krájení více bloků je důležité, aby byl tento držák před zahájením krájení nastaven do nulové polohy pro obě osy. Toho lze snadno dosáhnout pomocí červených indikátorů, bodů vrubu (zarážky kliknutím) a značek indikátorů.
9. ZJISTĚTE VÍCE O KONSTRUKČNÍCH VLASTNOSTECH VAŠEHO MIKROTOMU A O TOM, JAK JE POUŽÍVAT
Mikrotomy s retrakcí jsou navrženy tak, aby při pohybu čepele zpět do základní polohy (po ukrojení řezu) oddálil vzorek od čepele. Jde o velmi užitečnou vlastnost a je dobré vědět, zda váš mikrotom tuto schopnost má.
● Retrakce je konstrukční vlastnost, která poskytuje výrazné výhody během krájení a prodlužuje životnost čepele.
● Při použití mikrotomu, který má retrakci, musí být zarovnání čelní plochy bloku (vzorku) s ostřím nože provedeno s blokem při pohybu dolů (v přední poloze – bez retrakce).
● Pokud je blok zarovnán na ostří nože, zatímco je vzorkem pohybováno v retrakci, posune se blok při další plné otáčce ručního kola o hodnotu retrakce plus o vybranou tloušťku řezu. Výsledkem bude ukrojení silného řezu, který by mohl poškodit jak vzorek, tak čepel.
● Mikrotomy mohou být manuální, poloautomatické a nebo zcela automatické. Seznamte se se všemi možnostmi, které váš mikrotom nabízí.
● Plně automatizované mikrotomy omezují opakované pohyby rukou, a mohou tak usnadňovat práci zaměstnanců a přispívat k prevenci proti chronickým poškozením pohybového aparátu pracovníků.
10. PŘI ZKRAJOVÁNÍ VZORKŮ BUĎTE OPATRNÍ
Tato technika krájení vyžaduje velkou pozornost, protože může být jednoduše ztracena diagnosticky důležitá část vzorku.
● Před zahájením zkrajování vzorku se vždy ujistěte, že jsou všechny upínací mechanismy bezpečně utaženy.
● Cílem správného zkrájení bloku je dosažení takové úrovně vzorku, ve které lze získat reprezentativní řez.
● Zkrajování vzorku (tzv. trimming) se obvykle provádí při tloušťkách řezu mezi 10µm až 30µm.
● Rychlým a hrubým ořezáváním křehké tkáně riskujete poškození povrchu vzorku2. Zvláštní pozornost proto věnujte zkrajování vzorku při 30 μm.
● Jako poslední krok před finálním krájením tenkých řezů (po zkrájení vzorku) blok „vyleštěte“ jemným ukrojením několika tenkých řezů. Tím se vyhnete problému znázorněnému na obrázku 18B níže v textu.
Svorka základny držáku nože A, svorka B s bočním posuvem a svorka C orientovaná na x-y by měly být před zkrajováním bloku pevně zajištěny. Pokud tak neučiníte, může dojít k poškození bloku i čepele.
Při zkrajování by se mělo mechanické zařízení používat opatrně, zejména při nastavení v dolní poloze (..), které při aktivaci vytváří posun o 30 μm.
Při hrubém zakrajování vzorku je třeba používat řezací kolo opatrně, aby nedošlo k vyříznutí neúmyslně silných řezů z povrchu vzorku a tím k jejich poškození.
11. ZVAŽTE FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ TLOUŠŤKU ŘEZU
Mikrotomy je možné nastavit na požadovanou tloušťku řezu, ale mějte na paměti, že skutečnou tloušťku řezu určuje řada faktorů.
● Dobře ukrojený 4 μm tenký řez poskytne více kvalitních informací než nekvalitní 2 μm řez.
● Skutečná tloušťka prvních ukrojených řezů může být silnější, než je uvedeno v nastavení mikrotomu, a to kvůli tepelné roztažnosti3,4 při krájení studeného bloku (je to patrné z obrázku níže u řezů 1-3)
● Na skutečnou tloušťku mohou mít vliv další faktory, jako je rychlost otáčení ručního kola, nastavení úhlu nože a stav ostří.
12.UJISTĚTE SE, ŽE JSOU BLOKY SPRÁVNĚ NACHLAZENÉ
Krájení je obecně vylepšeno, pokud je vzorek a parafín dobře spojen v jeden celek. Z tohoto důvodu musí být většina parafínových bloků při krájení řezů dobře vychlazená. Metoda použitá k chlazení bloku je důležitá.
● Vychlazený parafín je lepší pro tvrdší části vzorku a lépe se tak získávají tenké řezy.
● Na několik minut umístěte blok na chladící plotnu nebo mokrý studený povrch (např. povrch tajícího ledu).
● Voda proniká do bloku jen mělce pod povrch, tkáň bobtná a činí tak blok přístupnější k řezání. To je zvláště důležité u příliš dehydratovaných, suchých nebo drobivých tkání.
● Umístění bloků do mrazáku může způsobit praskání povrchu, kde se tkáň odděluje od okolního parafínu. To může získání soudržných řezů ztížit.
Řezy vlevo byly ukrojeny při relativně vysoké teplotě bez předchozího zachlazení.
Řezy vpravo na obrázku byly ukrojeny ze stejného bloku, ale po zchlazení povrchu bloku na tajícím ledu.
13. NAUČTE SE TECHNIKU ŘEZÁNÍ KONZISTENTNÍCH, VYSOCE KVALITNÍCH A TENKÝCH ŘEZŮ
Zkušenosti laborantů nelze nahradit, existují však některé zásadní kroky, které úkol usnadní.
● Používejte na krájení finálních řezů nůž nebo stranu žiletky, která nebyla používána na zkrajování bloku.
● Při použití hrubého posuvu se vyvarujte krájení příliš silných řezů, protože by to poškodilo váš nůž a možná i blok se vzorkem.
● Znovu nachladit blok je potřeba vždy, když blok se vzorkem zteplají, např. při krájení více řezů.
● Pomalý a rovnoměrný řezný zdvih obecně přináší nejlepší výsledky a nejnižší kompresi řezů.
● Nezastavujte a nerestartujte během řezacího zdvihu, protože to způsobí vytvoření pruhů různé tloušťky napříč řezem.
● Běžnou praxí je v některých laboratořích jemné foukání na blok se vzorkem bezprostředně před krájením. Aplikace teplého a vlhkého dechu má tendenci dělat sekce soudržnějšími, způsobuje ale také tepelnou roztažnost, čímž je řez silnější3.
● Nečistoty ulpívající na horních nebo dolních okrajích bloku nebo na zadní straně čepele mohou ztěžovat získávání soudržných a sériových řezů a způsobit, že se sériový řez při zdvihu čepele zvedne. Pokud jsou přítomny nečistoty, odstraňte je, blok znovu ochlaďte a začněte znovu.
Tento sériový řez byl ukrojen pomalým a rovnoměrným tahem z dobře zpracovaného, důkladně vychlazeného bloku. Sekce vykazují velmi malou kompresi ještě před flotací.
14. VYBERTE SPRÁVNÁ PODLOŽNÍ SKLA
Volba správného podložního skla je velmi důležitá pro další kroky histologického procesu.
● Sklíčka musí být vždy správně skladovaná a bez mastnoty a prachu.
● Jestliže je jednou z dalších histologických technik po krájení použití IHC nebo ISH, tak musí být vždy použita adhezivní skla (tzv. potahovaná). Některá speciální barvení, zejména ta, která používají zásaditá činidla, mohou také způsobit „plavání“ řezů.
● Sklíčka musí být vždy přesně a vhodně označena způsobem, který je v souladu s místními předpisy laboratoře.
15. BUĎTE PŘI POUŽÍVÁNÍ VODNÍ LÁZNĚ OPATRNÍ NA VYPNUTÍ ŘEZŮ
Vypnutí řezů na vodní lázni by mělo po ukrojení dokonale vypnout řez do původní velikosti a vyrovnat všechny jeho nerovnosti.
● Správná teplota lázně je nezbytná. Teplota lázně by měla být nastavena na 5-9 °C pod bodem tání parafínu.
● Ujistěte se, že je voda čistá a bez bublinek. Pravidelně čistěte lázeň od zbytků parafínu z předchozích řezů.
● Řezy pokládejte na lázeň hladkou (lesklou) stranou řezu.
● Umisťujte sekce na vodní hladinu jemně a opatrně.
● Pokud odstraňujete vzniklé vrásky štětcem nebo pinzetou, dají se řezy velmi jednoduše poškodit.
● Prohlédněte si každý řez, který plave na vodní hladině. Snadno tak zjistíte jeho nedokonalosti.
● Ponechte řez na vodní hladině dostatečně dlouho, aby se vyrovnal. Nadměrná expanze může zkazit morfologii v náchylných částech vzorku.
● Abyste podpořili efektivní odvodnění a plavání řezů, vyjímejte skla při nabírání řezů z vodní lázně ve svislé poloze.
● Před umístěním sklíček do sušárny je na krátkou dobu umístěte do svislé polohy, abyste odstranili přebytečnou vodu.
● Mezi jednotlivými bloky čistěte vodní hladinu tkaninou, která nepouští vlákna, abyste předešli možnosti křížové kontaminace.
● Dávejte na vodní hladinu vždy jen řezy z jednoho krájeného bloku, abyste předešli možné záměně řezů.
Řezy ze dvou různých bloků nesmí být ve vodní lázni současně. I když mohou být vzorky jiného typu, existuje možnost křížové kontaminace a záměny vedoucí k nesprávné identifikaci vzorku. Tomuto postupu je proto vždy třeba se vyhnout.
16. PROVÁDĚJTE SPRÁVNĚ NÁSLEDNÉ SUŠENÍ ŘEZŮ
Správné sušení řezů zajišťuje, že jsou části zcela dehydrované, bez poškození teplem, ploché a během barvení pravděpodobně neodplavou.
● Před sušením řezů v sušárně „vypusťte“ přebytečnou vodu z pod řezu. To je velmi důležité, pokud jsou podložní sklíčka sušená naplocho na horké desce5.
● Sklíčka je možné skladovat ve stojanech ve svislé poloze a poté sušit v sušárně.
● Ujistěte se, že nastavená teplota termostatu není vyšší než 65 °C.
● Nadměrné teplo může způsobit, že se kapičky vody pod řezem během sušení budou vařit, což může způsobit poškození.
● Sušte řezy mezi 10 – 30 minutami.
● Některé vzorky poskytnou nejlepší výsledky, pokud budou sušeny při teplotě 37 °C po delší dobu (několik hodin až přes noc).
17. ZAJISTĚTE SPRÁVNOU ÚDRŽBU MIKROTOMU
Po použití mikrotomu je důležité odstranit nahromaděné zbytky tkáně a parafínu. Pravidelná preventivní údržba je velmi důležitá.
● Čistěte mikrotom denně.
● Vždy před čištěním mikrotomu vyjměte nůž nebo žiletku, abyste předešli poranění.
● Při čištění mikrotomu vyjměte i držák nože.
● Zbytky parafínových řezů se nejlépe odstraňují z mikrotomu suchým štětcem.
● Nepoužívejte k čištění mikrotomu a jeho povrchu alkohol nebo xylen, jelikož jeho části nejsou zpravidla odolné proti pravidelnému vystavování těmto látkám. Používejte k čištění mikrotomu produkty doporučené výrobcem, případně mýdlovou vodu.
● Během čištění nesmí do vnitřku přístroje vniknout žádná kapalina.
● Nechte si přistroj alespoň jednou do roka zkontrolovat odborným servisem.
● Dodržujte pokyny pro mazání mikrotomu uvedené v příručce s použitím doporučených produktů.
18.NAUČTE SE ROZPOZNÁVAT A OPRAVOVAT BĚŽNÉ CHYBY
Některé z nejběžnějších chyb při krájení jsou:
A. Příliš silný řez
● Špatně nastavený mikrotom
● Použití horkého dechu na vychlazený blok
● Jedná se o první řez na sériovém řezu
● Ukrojení přílišnou rychlostí
● Špatné zpracování bloku
● Mikrotom je potřeba zkalibrovat
B. Díry vzniklé při zkrajování bloku
● Blok byl zkrájen příliš rychle
● Povrch bloku nebyl po zkrájení vyleštěn
● Nevhodná síla řezu při zkrajování
● Blok je příliš křehký (důsledek špatného zpracování) nebo byl příliš vychlazen
C. Viditelné linie po řezu (vertikální)
● Použití poškozeného nože nebo žiletky
● Špatné zpracování
● Příliš tvrdý vzorek jako např. vápníkové fragmenty ve vzorku
● Nekvalitní nebo špatně přefiltrovaný parafín
● Soli pufru vysrážené ve vzorku
D. Narušení tkáně
● Hrubé zacházení se vzorkem během krájení
● Špatné zpracování (nekompletní dehydratace, čištění nebo infiltrace parafínem)
● Porušení řezu během vypínání na vodní lázni
● Plutí řezu na vodní hladině příliš dlouho nebo v příliš horké lázni
E. Jemné praskliny nebo mikrotrhliny
● Špatné zpracování
● Blok byl příliš studený
● Příliš rychlé krájení
● Špatně upnutý blok ve svorce
● Je potřeba vyladit úhel krájení
F. Hrubé linie
● Špatně upnutý blok
● Velmi tvrdý nebo velký vzorek
● Špatné zpracování
● Špatně nastavený úhel nože
● Příliš rychlé krájení
● Opotřebovaný mikrotom
G. Záhyby (přehnutá tkáň)
● Špatná technika napínání řezu na vodní lázni
● Špatná fixace a/nebo zpracování tkáně
● Příliš teplý blok
● Příliš slabé řezy
● Příliš velký úhel nože
● Příliš horká vodní lázeň
H. Nadměrná komprese
● Špatné zpracování
● Teplý blok
● Příliš rychlé krájení
● Tupý nůž nebo žiletka
● Příliš velký úhel nože
● Špatná kvalita parafínu
I. Bublinky pod řezem
● Bublinky ulpívající na dně a okrajích vodní lázně
● Špatná technika napínání řezů, která nechává bubliny pod řezem
J. Nadměrná expanze během plavání na vodní lázni
● Teplota lázně je příliš horká
● Řez byl příliš dlouho ponechán ve vodě
● Špatná fixace vzorku a / nebo špatné zpracování (zbytkové rozpouštědlo)
K. Řez není rovný (plochý) – špatná přilnavost ke sklu
● Špatná kvalita řezu (vrásky, bubliny)
● Příliš studená vodní lázeň
● Použití nepotahovaného podložního skla u problematických vzorků
● Zbytková voda pod řezem po napnutí na sklo
● Špatný čas sušení řezu
● Příliš nízká teplota sušení
I. Prachové částice
● Špinavé podložní sklo
● Kontaminovaná vodní lázeň
● Skla byla špatně skladovaná (prašné prostředí)
● Zbytky tužky po označování skla
REFERENCE
1. Leica Biosystems. Instruction Manual Leica RM2235 V1.3 Nussloch: Leica Biosystems, 2008.
2. Rolls GO, Farmer NJ, Hall JB. Artifacts in Histological and Cytological Preparations. Melbourne: Leica Biosystems, 2008;106.
3. Rolls G. 101 Steps to Better Histology. Melbourne: Leica Biosystems, 2008.
4. Culling CFA, Allison RT, Barr WT. Cellular Pathology Technique. 4th ed. London: Butterworths, 1985.
5. Santoianni RA, Hammami A. Nuclear Bubbling an Overlooked Artifact. The Journal of Histotechnology, 1990;13;135‑136.
(Převzato od společnosti Leica Biosystems, redakčně upraveno.)