Polarizační kontrast

Autor: Wymke Ockenga

Úvod

Polarizační mikroskopie se rutinně používá v materiálových vědách a geologii k identifikaci minerálů na základě jejich charakteristických lomových vlastností a barev. V biologii a patologii se polarizační mikroskopy běžně používají k identifikaci nebo zobrazení dvojlomných struktur, jako jsou krystaly či cizorodé látky, nebo pro zobrazení celulózy v buněčných stěnách rostlin a škrobových zrn.

 

Dvojlom je klíčem k polarizační mikroskopii

Dvojlomné objekty mají vlastnost štěpení jednotlivých paprsků světla na dva sesterské paprsky – řádný a mimořádný. Dvojlomné materiály se skládají z materiálů s vysoce uspořádanou molekulární strukturou, jako jsou krystaly vápence (kalcitu) nebo nitridu boritého. Biologické vzorky jako je celulóza nebo škrob jsou také dvojlomné. Dvojlom v kombinaci s lineárně polarizovaným světlem může být v mikroskopii využit k dosažení interference mezi dvěma sesterskými paprsky, což může způsobovat barevné efekty, jako jsou kruhy a zesvětlení struktur.

 

Poloha a dráha paprsku polarizačního mikroskopu

Běžný optický mikroskop potřebuje k provedení polarizační mikroskopie alespoň dvě další komponenty. K detekci dvojlomu je nutné použít lineárně polarizované světlo pro iluminaci. Z toho důvodu musí být do cesty paprsku vloženy dva polarizační filtry. První polarizační filtr produkuje polarizované světlo pro osvětlení vzorku a druhý polarizační filtr, který se nazývá analyzátor, omezuje detekované světlo na světlo lomené.

Polarizační filtry musí být vůči sobě navzájem v úhlu 90°, aby bylo dosaženo takzvané „tmavé pozice“. Pokud jsou polarizační filtry nastaveny do této polohy, neprojde do kamery ani okulárů žádné světlo, a tím pádem bude obraz tmavý. Nastavení tmavé pozice je důležitým krokem pro mikroskopii polarizovaného světla, protože zajišťuje, že bude viditelné pouze to světlo, u kterého došlo kvůli vzorku ke změně polarizační roviny.

 

Obr.1: Principy polarizačního mikroskopu: Nepolarizované světlo je polarizováno polarizátorem 1. Po průchodu polarizátorem 1 je světlo zaostřeno na vzorek kondenzátorem. Pokud je vzorek dvojlomný nebo obsahuje dvojlomné struktury, bude rovina polarizace části světla stočena o úhel 90° (červené čáry na obrázku). Obraz vzorku je zvětšen objektivem a dopadá na polarizátor 2. Bude-li polarizátor 2 natočen o 90° vůči polarizátoru 1 (tzv. „tmavá pozice“), může projít pouze světlo, které prošlo dvojlomným materiálem a může být viditelné pozorovateli. Proto jsou viditelné pouze polarizační struktury.

 

Polarizátor a analyzátor

Když světlo prochází prvním polarizačním filtrem, je produkováno lineárně polarizované světlo. Pokud lineárně polarizované světlo prochází dvojlomným materiálem ve správné polarizační rovině, je lomeno a rozděleno na dva sesterské paprsky a polarizační rovina části paprsků je otočena o 90°. Lomené paprsky světla pak procházejí druhým polarizátorem (analyzátorem), pokud je správně otočen (tj. 90° vzhledem k prvnímu polarizačnímu filtru). Z toho důvodu produkují obraz v polarizačním mikroskopu pouze dvojlomné materiály.

 

Obr. 2: Sluneční světlo nebo světlo produkované žárovkou je nepolarizované. To znamená, že elektromagnetické vlny kmitají ve všech směrech. Pokud nepolarizované světlo prochází polarizátorem 1, vytváří se světlo s dobře definovanou polarizací, v tomto případě vertikálně polarizované světlo. Pokud toto polarizované světlo pak zasáhne polarizátor 2, který je otočen o 90°, tak neprojde žádné světlo polarizátorem 2. Pokud jsou tedy dva polarizátory vůči sobě navzájem otočeny o 90°, jsou v tak zvaném „tmavém poli“, protože za druhým polarizátorem již není vidět žádné světlo.

 

Je důležité, aby polarizační osa dvojlomného materiálu, který je zkoumán, byla ve stejné polarizační ose jako světlo produkované prvním polarizátorem. Z toho důvodu je hodně polarizačních mikroskopů vybaveno otočným stolkem, který zajišťuje snadné vyrovnání polarizační roviny objektu k polarizační rovině prvního polarizačního filtru. Pro speciální aplikace v polarizační mikroskopii jsou k dispozici různé doplňky.

Bertrandova čočka se používá pro konoskopické pozorování vzorů krystalů zaostřených v zadní cloně objektivu. Pro kvantitativní analýzu dvojlomných vzorků je navíc užitečná retardační deska nebo kompenzátor.

 

Aplikace polarizační mikroskopie

Typicky jednolomné látky, které zůstávají při zkřížených filtrech tmavé (nezobrazené), jsou voda, cytoplasma a buněčné jádro. Naopak lze zobrazit různé krystaly (obr. 3).

V patologii se polarizační mikroskopie používá v případech, kdy je potřeba vyloučit chyby vzniklé dvojlomem nebo prokázat přítomnost opticky aktivních struktur (obr. 4) či cizorodých látek (sklo, stehový materiál).

 

Obr. 3: Krystaly cholesterolu v polarizačním mikroskopu.

Převzato WikiSkripta, CC BY 3.0

 

Obr. 4: Srdeční amyloidóza s depozity amyloidu extracelulárně (červená uskupení, barvení Konžská červeň).

Převzato WikiSkripta, CC BY-SA 3.0

 

Obr. 5: Zachycená moucha v baltském jantaru. I když je jantar amorfní látkou a teoreticky opticky izotropní, tokové struktury pryskyřice, způsobené vnitřním napětím i napětím způsobeným inkluzí, lze vizualizovat v polarizovaném světle. Použití polarizovaného světla a červeného kompenzátoru prvního řádu vedlo k intenzivním barvám v jinak zlatém jantaru. Kombinace tmavého pole a dopadajícího světla (skleněná vlákna), zkřížené polarizátory, kompenzátor red-1, tónové mapování HDRI. Se svolením Michaela Hügiho, Švýcarská Gemmologická Společnost, Bern, Švýcarsko.

 

Obr. 6: Kobalt, válcovaný za studena, lept Berahového typu, polarizace. Zkoumání morfologie mikrostruktury hraje rozhodující roli ve vědě o materiálech a analýze vad. Barevný kontrast a formaci specifických mikrostruktur lze často zlepšit optickou polarizací leptaných vzorků pod polarizačním mikroskopem. Se svolením Ursuly Christian, Univerzita Pforzheim, Německo.

 

Obr. 7: Kyselina vinná, polarizace

 

Obr. 8: Hliník, lept Baker, polarizace

 

(Převzato ze zahraničního zdroje, redakčně upraveno a rozšířeno.)

 

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací