Pohled dovnitř buněk pomocí barvení: Barvení organel

vytvořeno: 17.8.2021

(Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

Vizualizace vnitřního prostředí organel nám pomáhá pochopit molekulární mechanismy a abnormality v hodnocených buňkách.

 

Nejprve bychom si ale měli říct, co je organela. Organely jsou malé subcelulární struktury nacházející se v cytoplazmě eukaryotických a prokaryotických buněk a ve složitějších eukaryotických buňkách, které jsou často obaleny vlastní membránou. Každá organela vykonává v buňce specifickou funkci podobně jako orgán v organismu. 

Kromě toho, že můžeme používat markery proteinů specifických pro jednotlivé organely, můžeme ke studiu organel používat také barviva, která zvýrazní předmětné specializované struktury, a napomohou tak při jejich výzkumu. Níže shrnujeme, jak co nejlépe využít barvení k identifikaci jednotlivých buněčných organel (obr. 1).

Obr. 1 Živočišná buňka se zvýrazněním některých základních organel, které lze barvit barvivy specifickými pro jednotlivé organely.

 

Před výběrem barviva je třeba zvážit čtyři aspekty:

Než probereme jednotlivá barviva vhodná pro různé organely, musíme nejprve zvážit určité aspekty, abychom zajistili, že při barvení dosáhneme těch nejlepších výsledků.

 

1. Zvažte propustnost membrány pro barvivo.

DAPI má nízkou membránovou permeabilitu a je vhodné pro barvení fixovaných buněk. Hoechst (např. 33342) má vyšší membránovou permeabilitu a lze je použít i v živých buňkách.

 

2. Zvažte vlnovou délku fluorescence.

Pokud chcete například identifikovat určitý protein na lipidové membráně pomocí sekundární protilátky vyzařující světlo v zeleném spektru, bude nejvhodnější zvolit lipidové barvivo, které vyzařuje světlo na konci červené části spektra. Můžete se tak vyhnout jejich vzájemné interferenci.

 

3. Koncentrace barviva je naprosto zásadní.

Příliš nízká koncentrace nezajistí dostatečnou vizualizaci a příliš vysoká koncentrace bude zase pro vaše vzorky toxická.

 

4. Důkladně se obeznamte s mechanismem fungování barviva.

Mitochondriální barviva, jako je Rhodamin, závisí na membránovém potenciálu. Lze je použít pouze na živé buňky, a proto jsou užitečnými nástroji k analýze zdraví a životaschopnosti buněk. Lyzozomální barviva ke správnému fungování potřebují kyselé prostředí organely. Také nejlépe fungují v živých buňkách.

 

Různá barviva pro různé organely

 

1. Plazmatická membrána a Golgiho aparát

Celá buňka je obalena fosfolipidovou dvouvrstvou – plazmatickou membránou – a obsahuje v cytoplazmě několik membránových struktur. Pro regulaci vnitřního prostředí a transport proteinů v buňce je velice důležitá selektivní permeabilita plazmatické membrány a tvorba vezikulů.

Proto je nezbytné zohlednit membránovou permeabilitu barviva. K barvení membrán lze použít lektiny, což jsou proteiny vázající sacharidy, které rozpoznávají určité části cukrů a vážou se na ně.

Lektiny, jako je například aglutinin z pšeničných klíčků (WGA), barví nejen plazmatickou membránu, ale i Golgiho aparát, což je organela sestávající z mnoha membránových váčků a vezikulů účastnící se nitrobuněčného zpracování proteinů. Obě struktury jsou tvořeny fosfolipidovou dvouvrstvou a obě lze barvit lektiny.

Pozor: Některé lektiny jsou specifické pro konkrétní glykolipidy a glykoproteiny. To je nesmírně užitečné při zobrazování různých typů buněk. Například lektin IsoB4 specificky barví endoteliální buňky, neboť se váže na jejich bazální membránu.

 

2. ER a lipidové kapénky

Endoplazmatické retikulum (ER) je další membránový systém, který je propojený s jadernou membránou a podílí se na zpracování lipidů a proteinů. Kanálky, cisterny a zploštělé váčky ER mohou tvořit až 10 % objemu celé buňky. ER se skládá z drsného ER (je pokryto ribozomy a podílí se na produkci proteinů) a hladkého ER (není pokryto ribozomy a podílí se na metabolismu lipidů). Barviva, jako je nilská červeň, se vážou na lipidové kapénky a barví všechny lipofilní membrány a také lipidové kapénky uvnitř buněk. Tato barviva však mohou způsobovat výrazné zabarvení pozadí, proto je třeba pečlivé optimalizace, abychom dosáhli spolehlivých výsledků.

Pozor: Ošetření buněk kyselinou olejovou před barvením barvivy specifickými pro lipidy vyvolává tvorbu lipidových kapének. Tuto skutečnost lze využít pro pozitivní kontrolu a ověření, zda barvivo funguje podle očekávání.

 

3. Lyzozomy

Lyzozomy lze označit za trávicí systém buňky, neboť obsahují degradační enzymy. Aby funkce těchto enzymů zůstala zachována, musí se lyzozom nacházet v kyselém prostředí (kolem pH 5), tedy nikoliv v neutrálním pH cytoplazmy. To znamená, že lyzozomy vyžadují aktivní transport protonů z cytoplazmy. Nejvhodnější je použít barvivo pronikající do buňky, které funguje specificky v kyselém prostředí a v důsledku gradientu pH se shromažďuje v lyzozomu.

Pozor: Barviva určená k barvení lyzozomů, jako je neutrální červeň, vyžadují, aby tato organela zůstala v kyselém prostředí a nejlépe fungují v živých buňkách. Jedním z tipů na barvení je nejprve přidat lyzozomální barvivo a teprve poté provést fixaci buněk. Tak je možné následně přidat protilátky specifické pro proteiny.

 

4. Mitochondrie

Mitochondrie lze přirovnat k buněčné elektrárně. Prostřednictvím oxidativní fosforylace vyrábějí téměř 90 % energie potřebné k udržení buňky při životě a sehrávají také klíčovou úlohu v procesu apoptózy. Sestávají ze dvou membrán, na nichž s využitím protonového gradientu dochází k syntéze molekul ATP sloužících jako dočasné úložiště energie. Tento membránový potenciál umožňuje použití mitochondriálních barviv, jako je rhodamin, která mohou posloužit jako užitečný nástroj pro analýzu buněčného zdraví a životaschopnosti živých buněk. Rhodamin lze však použít pouze bezprostředně před fixací, protože při ní dochází k degradaci membránového potenciálu.

Pozor: Rhodamin je toxický a inhibuje funkci mitochondrií.

 

5. Mikrotubuly

Mikrotubuly jsou spolu s aktinem a intermediárními filamenty jedním ze stavebních prvků buňky tvořících cytoskelet. Mikrotubuly sice nejsou striktně vzato organely, ale jsou důležité pro pochopení základních procesů, kterými se buňky řídí, a mohou také pomoci při vizualizaci celé buňky. Lze je zvýraznit pomocí tubulinových barviv, která mohou v závislosti na specifické vazebné afinitě ovlivnit dynamiku mikrotubulů a zastavit mitózu. 

Pozor: Namísto paraformaldehydu použijte k fixaci raději metanol. Zabráníte tak nežádoucímu zesíťování proteinů a získáte kvalitnější zobrazení.

Obr. 2 Imunofluorescenční analýza buněk HepG2 fixovaných 4% PFA s použitím protilátek proti FIS1 a alfa tubulinu. Zelená: FIS1 (10956-1-AP); červená: alfa tubulin (66031-1-Ig)

 

Nezapomínejte, že na barviva se spolehnout můžete!

Použití barviv je vedle barvení protilátkami jednoduchým a účinným způsobem, jak můžete při výzkumu vizualizovat buněčné organely. Důkladně prozkoumejte různé možnosti, které se nabízejí, a zajistěte si tak nejlepší šance na úspěch!

Další informace o přípravě vzorků pro imunofluorescenční mikroskopii naleznete zde na našem blogu.

Obr. 3 Imunofluorescenční analýza buněk lidské slinivky břišní fixovaných 4% PFA s použitím protilátek proti glukagonu a inzulinu. Zelená: glukagon (15954-1-AP); červená: inzulin (66198-1-Ig)

 

(Zdroj originálního textu: Proteintech. Redakčně upraveno.)

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací