Nejlepší tipy pro zamrazování a rozmrazování buněk pro udržení jejich životaschopnosti

vytvořeno: 14.10.2021

Kryokonzervace je zavedená laboratorní technika používaná k uchovávání buněk a jiného biologického materiálu při teplotě blízké teplotě kapalného dusíku (-196°C). Poskytuje vědcům záložní materiál, pokud by došlo ke ztrátě rostoucích buněk v důsledku kontaminace, a pomáhá minimalizovat výskyt genetického driftu tím, že umožňuje, aby mohly být použity buňky s nízkým číslem pasáže, pokud byly současné kultury pěstovány již po delší dobu. Tento článek pojednává o osvědčených postupech pro zamrazování a rozmrazování buněk, aby byla udržena jejich vysoká životaschopnost.

 

1. Před zamrazením zkontrolujte zdravotní stav buněk

V ideálním případě by buňky měly být zamrazeny ve stavu nízkého čísla pasáže, kdy měly buněčné charakteristiky ještě málo času na změnu, která by případně mohla nastat v důsledku prodlouženého pasážování. Před zamrazením buněk je důležité provést kontrolu životaschopnosti buněk pomocí trypanové modři nebo jiného vitálního/nevitálního barvení a zkontrolovat kontaminaci zhodnocením sterility a testem na mykoplazmu.

 

2. Zamrazujte buňky během jejich logaritmické fáze růstu a ve vhodné koncentraci

Zpasážování buněk nebo obměnění růstového média 1–2 dny před zamrazením zajistí, že jsou buňky zdravé a v aktivní fázi růstu. Například adherentní buňky by měly být v ideálním případě přibližně na 70–80 % jejich maximální konfluence/hustoty během sklízení za účelem zmrazení. Koncentrace, při které jsou buňky zamrazovány, se může mezi různými druhy kultur lišit, ale obvykle se pohybuje v oblasti 1 x 106 – 5 x 106 buněk/ml v mrazicím médiu; zamrazování buněk o příliš nízké nebo příliš vysoké hustotě může mít dopad na jejich životaschopnost a mělo by se tomu pokud možno zabránit.

 

3. Používejte vhodné zamrazovací médium

Kryokonzervační médium obvykle obsahuje růstové médium, kryoprotektant, jako je DMSO nebo glycerol, a zdroj proteinu (obvykle sérum). Ačkoli je kryoprotektant nezbytný k prevenci buněčného stresu během procesu zmrazení a rozmrazení, je možné vynechat sérum; v situacích, kdy je třeba se vyhnout séru, lze tuto složku růstového média doplnit kondiciovaným médiem bez obsahu séra nebo 10% BSA vhodným pro buněčné kultury.

 

4. S procesem zamrazování začněte co nejdříve

Aby byla zachována životaschopnost buněk, měl by proces zamrazování začít ihned poté, jakmile bylo k buňkám přidáno mrazicí médium. Umístění kryovialek na mokrý led předtím, než budou přeneseny do mrazicí nádoby, může tento proces urychlit.

 

5. Buňky zamrazujte pomalu

Pomalé zamrazování buněk je nezbytné pro to, aby se zabránilo tvorbě intracelulárního ledu, a lze jej dosáhnout použitím zamrazovací nádoby, která umožňuje udržet rychlost zamrazování o 1°C za minutu. Tato nádoba by měla být umístěna v -80°C po dobu minimálně 4 hodin, ale ideálně přes noc, jakmile do ní byly přidány kryovialky obsahující buňky. Systémy bez isopropanolu zabraňují nadbytečným nákladům a nepříjemnostem vznikajícím při pravidelné výměně alkoholu a zajišťují rovnoměrnější zamrazování důležité pro to, aby se zachovala životaschopnost buněk.

 

6. Zkontrolujte zásoby zamražených buněk před přenesením do kapalného dusíku

Jakmile byly buňky zmrazeny na -80°C, může být užitečné obětovat jednu z lahviček, aby bylo potvrzeno, že připravené zásoby buněk jsou životaschopné a nejsou kontaminovány ještě před tím, než je přenesen zbytek buněk do kapalného dusíku. Ponechání buněk při -80°C po delší dobu však může ovlivnit zdraví buněk, a proto by měl být jejich přenos do kapalného dusíku proveden co nejdříve po dokončení všech kontrol.

 

7. Skladujte buňky v plynné fázi kapalného dusíku

Buňky by měly být skladovány v plynné fázi kapalného dusíku, aby se zabránilo vniknutí kapaliny do zkumavek. To by mohlo vést nejen ke kontaminaci, ale také k povolení či prasknutí lahviček, protože se  kapalina po rozmrazení rozpíná.

 

8. Zajistěte, aby zůstaly buňky před rozmrazením pro použití zmražené

Aby se zabránilo narušení životaschopnosti buněk, neměly by být zamrazené buňky nikdy přenášeny z kapalného dusíku do laboratoře na vlhkém ledu. Vždy musí být použit suchý led nebo nádoba na tekutý dusík, zejména pokud mají být buňky přepravovány na větší vzdálenost nebo po delší čas.

 

9. Buňky rozmrazujte rychle

Jakmile byly buňky vyjmuty ze skladu s kapalným dusíkem, měla by být kryovialka umístěna do vodní lázně o teplotě 37°C, dokud nebude obsah čerstvě po kompletním rozmrazení. Buňky by pak měly být okamžitě přeneseny do velkého objemu předehřátého média, citlivější typy buněk (kmenové buňky, primární buňky) pak po kapkách, aby byla zachována jejich životaschopnost. Ačkoli některé buňky mohou být jemně stočeny pomocí centrifugace těsně před tím, než jsou jemně resuspendovány pipetou a přidány do lahvičky pro buněčnou kulturu obsahující předehřáté růstové médium, pro jiné typy buněk je vhodnější (šetrnější) přenést buňky do lahvičky ihned po rozmrazení a provést změnu média následující den, aby se odstranil jakýkoli zbytkový kryoprotektant.

 

10. Ujistěte se, že nedávno rozmražené buňky jsou zdravé

Rychlá vizuální kontrola může poskytnout včasnou indikaci zdravotního stavu buněk. Příkladem je potvrzení, že se adherentní buňky připojily ke dnu lahvičky. Jakákoli pozorování mohou být dále doplněna kontrolou životaschopnosti buněk po jejich první pasáži.

 

(Převzato ze zahraničního zdroje, redakčně upraveno.)

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací