Nastavení úhlu nože či žiletky u mikrotomu

vytvořeno: 28.8.2020

Nastavení úhlu nože či žiletky u mikrotomu

Pro pozorování biologické tkáně pod mikroskopem je tkáň obvykle potřeba připravit nařezáním na tenké plátky. Většina biologických tkání je však na řez příliš měkká; nůž by do něj tlačil a stlačil by jej, přestože je jeho ostří velmi ostré. Tkáň je proto buď zmražená a nařezaná v kryostatu, nebo zapuštěna do vytvrzovacího materiálu, jako je parafín nebo pryskyřice. Případně je tkáň řezána měkká za pomocí vibračního mikrotomu, tzv. vibratomu.

Správný úhel nože je předmětem mnoha nedorozumění, zavádějících zkušeností a nesprávných informací předávaných mezi odbornými pracovníky. Ve skutečnosti lze přitom vše logicky odvodit.

Ideál versus kompromis

Ideálním nožem pro řezání jakéhokoli materiálu v jakémkoli mikrotomu, bez ohledu na tvrdost vzorku, by byla nekonečně tenká rovina. Tato rovina by byla orientována rovnoběžně s rovinou řezného pohybu. Bohužel, nekonečně tenká rovina není možná a ve skutečnosti se tato teorie vyskytuje pouze v knihách o geometrii.

Skutečné nože jsou kompromisem, respektive několika kompromisy mezi fyzikou, dostupnými materiály, zpracovatelností a náklady na výrobu. Nože nebo žiletky musí mít měřitelnou tloušťku, aby byly během řezání stabilní. Přední hrana nože musí být tenčí než hlavní tělo nože v klínovém tvaru a to tak, aby bylo možné řezání a přitom byla zajištěna fyzická nepružnost. Všechny mikrotomové nože, ať už opakovaně použitelné nebo jednorázové žiletky, mají tzv. klínový díl.

Obr. 1a-c: a: správný úhel nože, b: příliš malý úhel, c: příliš velký úhel

Obr. 1a-c: a: správný úhel nože, b: příliš malý úhel, c: příliš velký úhel

Celý nůž by teoreticky mohl být jeden hladký klín s pozvolným sklonem k přední hraně. Naostření nože by však vyžadovalo odstranění vrstvy z alespoň jedné celé plochy nože. V praxi se vždy jedná o poslední zkosení ve strmějším úhlu asi milimetr od začátku ostří. Konečné zkosení může nebo nemusí být symetrické na obou stranách. Konečné zkosení nože pomáhá při ostření a opětovném broušení, pro opětovné broušení je poté třeba odstranit pouze plochu zkosené části nože.

V mikrotomu je středová čára průřezem nože, jak je znázorněno na obr. 1a, a je vždy umístěna v úhlu k hlavnímu směru pohybu, nikoli rovnoběžně se směrem pohybu, jako by to bylo ideální pro nekonečně tenký nůž. Toto je nutné kvůli zkosení nože. Úhel je vyžadován, protože nůž má v příčném řezu tvar klínu (alespoň jeho zkosená přední hrana). Tento kompromis ve srovnání s ideálním nožem (nekonečná rovina) má dva negativní důsledky.

1) Důsledky příliš malého úhlu nože

Předpokládejme, že je nůž držen tak, že rovina pohybu (nože nebo vzorku) je rovnoběžná se středovou čarou vedoucí skrz klín, což by bylo vhodné pro ideální nůž (obr. 1b). Přední hrana zkosení nože na straně vzorku by pak byla tlačena tvrdě na vzorek, stále více s větším pohybem řezu, a působila stlačeným a dopředným tlakem na vzorek. To nikdy není dobré a existuje několik možných důsledků, které závisí na vlastnostech tkáně, vlastnostech nože a na tom, jak dobře je vzorek držen na držáku vzorku:

Pokud je tkáň příliš měkká, bude řez řezán, ale čelní plocha bloku, z níž bude další řez pocházet, bude stlačena dolů a dopředu, odřena a poškozena. Nejběžnějším výsledkem je střídání tlustých a tenkých řezů (k tomu může docházet také tehdy, když nůž nebo držák vzorku nejsou pevně zajištěny a upevněny).

Pokud je tkáň příliš tvrdá nebo je použita vibrační čepel, výsledkem tlaku nemusí být stlačení tkáně, ale ohnutí nože nahoru. Pokud lze nůž ohnout, může tzv. „bruslit“ po tkáni a oddělit tak částečné fragmenty nebo vytvořit vlnitý vzor na povrchu bloku zvaný žaluzie, kde se nůž vychyluje směrem nahoru a pak se vrací zpět. K určitému stupni zvlnění vzorku může dojít i při správném úhlu nože, ovšem v důsledku stlačení vzorku před nožem.

Přílišné zatlačení bloku vzorku dopředu může způsobit, že se blok se vzorkem vylomí. Poučením je, že nůž vždy potřebuje dostatečně velký úhel k tomu, aby se zabránilo tomu, že koncová část spodní plochy zkosení nože působí na blok vzorku.

Obr. 2: Příklad poloautomatického vibračního mikrotomu, který je navržen pro dělení pevných nebo nefixovaných vzorků v neuropatologii (krájení čerstvého mozku) a neurofyziologii. Takový nástroj je doporučen pro uživatele, kteří si chtějí ručně vybrat požadovanou tloušťku řezu před řezáním každé sekce. Svislé vychýlení lze měřit pomocí volitelného měřícího zařízení.

2) Důsledky příliš velkého úhlu

Předpokládejme, že je nůž umístěn ve velkém úhlu mezi středovou čarou průřezu nože a osou pohybu, takže spodní strana klínu již netlačí na blok dolů a dopředu (obrázek 1c). Horní plocha klínu však vždy tlačí na nezřezaný vzorek nad řeznou hranou. To ohýbá řez vzorku velmi ostře nahoru v linii řezu, protože je oddělen od vzorku. Stejně jako u jakéhokoli předmětu s ohnutou tloušťkou bude spodní povrch řezu v ohybu natažen a dojde k separacím, zatímco horní povrch bude komprimován. Pokud se zdeformovaný vzorek nevrátí zpět, dojde k jeho těsnému zabalení do „ruličky“. I když se odpruží a zabrání se zabalení řezu, řez se změní. V závislosti na vlastnostech vzorku a nože existuje opět několik možných důsledků tohoto nastavení:

  Pokud je nůž flexibilní a vzorek je tvrdý, může se nůž ohnout dolů a zaříznout se do bloku vzorku a způsobit tak hluboký zářez do vzorku.

 • Pokud je vzorek příliš tvrdý a nůž neflexibilní, může dojít k vylomení vzorku z bloku.

 • Jestliže je vzorek špatně ukotven, mohou vznikat nerovnosti a škrábance na vzorku místo hladkého řezu.

  Jestliže je vzorek tkáně příliš měkký, může se tkáň příliš pevně balit do ruličky, kterou již nebude možné roztáhnout.

Jaký je tedy správný úhel nože?

Obecně platí, že přílišné ohýbání jednotlivých řezů při krájení vzorku není nikdy v histologii výhodné. Nastavení příliš malého úhlu nože (obr. 1b) je však pro vzorek škodlivější než chyby vzniklé příliš velkým úhlem (1c). To vede k jednoznačnému závěru, že správný úhel nože by měl být vždy nastaven následujícím způsobem:

Umístěte spodní plochu zkosení na konci nože rovnoběžně s blokem vzorku a rovinou pohybu. Potom mírně zvětšete úhel (1/2 stupně, pokud to dokážete) nad úhel zkosení, abyste zabránili tomu, že se spodní část zkosené plochy sklouzne přes blok vzorku a vzorek se poškodí třením nože. Správné nastavení úhlu nože vůči vzorku by mělo být vždy konzistentní bez ohledu na typ mikrotomu nebo jakoukoli vlastnost řezaného vzorku.

Důsledky nesprávného nastavení úhlu nože se budou lišit v závislosti na rozdílných vlastnostech a typech vzorku, fixace a zpracování vzorku i v rozdílech ve flexibilitě nože. Je třeba vzít v úvahu také vlastnosti nože nebo jednorázových žiletek, protože je lze vyrobit v různých profilech a s různými úhly. Správný úhel nože je vlastností závisející na daném typu nože a konečného zkosení. Může se lišit na nožích od různých výrobců, a může se po opětném naostření změnit. Aby se snížila pravděpodobnost změn úhlu nože při ostření, měl by být nůž vždy ostře nabroušen.

O autorovi 

Charles W. Scouten, Ph.D. – Manažer inovací Leica Biosystems Charles Scouten, produktový specialista, MNL, Biosystems Division, Richmond, IL, se narodil v Eckelson v Severní Dakotě v USA. V roce 1980 získal doktorát ze SUNY Binghamton.

Charles Scouten v současné době řídí výzkumné nástroje v oblasti neurovědy včetně řady stereotaxických nástrojů a souvisejících produktů, které vyvinul v rámci osmi grantů pro malé inovační podniky. V roce 2007 vstoupil do společnosti Leica Microsystems s akvizicí společnosti Coretech Holdings Acquisition. Byl zakládajícím partnerem na serveru MyNeurolab.com, který částečně vlastní společnost Coretech Holdings.

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací