Jednoduchý průvodce výběrem substrátů pro imunohistochemii od společnosti Vector Laboratories

kategorie: imunohistochemie
vytvořeno: 23.2.2022

(Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

 

Autor: Camila Suhett, PhD

 

Imunohistochemické (IHC) mikrosnímky často vypadají jako malá umělecká díla – spletité struktury v zářivých kontrastních barvách. Možná jste už někdy v minulosti takový snímek také pořídili a jste na něj právem pyšní. Když jako vědecko-výzkumný pracovník plánujete nějaký experiment, patrně o barevném odstínu, jasu či sytosti barev nepřemýšlíte. To však neznamená, že je stanovení správných IHC substrátů – což je při testování zásadní rozhodnutí – snadné.

IHC substráty jsou k dispozici v celé řadě různých typů a barev, přičemž je pro vaše rozhodování nezbytná i znalost specifických technických faktorů. Pokud jde o výběr substrátu pro IHC, můžete flexibilně vybírat ze široké nabídky. Naším cílem je pomoci vám dojít ke správnému rozhodnutí. V rámci tohoto článku probereme různé faktory, které je třeba zvážit (enzym, citlivost, barvu, metodu vizualizace a stabilitu) při výběru vhodného substrátu (potažmo barvy) pro váš experiment.

 

Tenké střevo: CD10 (m), VECTASTAIN® Elite® ABC Kit, substrát ImmPact® DAB HRP (hnědá). Kontrastní barvivo Hematoxylin QS (modrá). 

Enzym

IHC detekční systémy obvykle obsahují dva různé enzymy – křenovou peroxidázu (HRP) a alkalickou fosfatázu (AP) – a to je první faktor, který je třeba vzít v úvahu při výběru IHC substrátu. Detekční systémy na bázi HRP vytvářejí ostře ohraničené a husté sraženiny. Je-li třeba detekovat nitrobuněčné cíle nebo přesně ohraničená místa, použití detekčních systémů na bázi HRP je často nejpřínosnější. Naproti tomu detekční systémy na bázi AP jsou vhodnější pro vizualizaci základní tkáňové struktury, protože jsou jejich sraženiny neohraničené a průsvitné.

HRP substráty vedou ke vzniku ostře ohraničených a hustých reakčních produktů; AP substráty vytvářejí méně ohraničené a průsvitné sraženiny.

Je třeba mít také na paměti, že substráty jsou specifické pro dané enzymy: HRP substrát nebude reagovat s detekčním systémem na bázi AP a naopak. Tato specifičnost vnáší do vašich experimentů ještě větší flexibilitu, protože umožňuje větší počet barvení, přičemž může pomoci předcházet problémům s aktivitou endogenních enzymů prostou výměnou enzymatického detekčního systému.

Barva

Při výběru barvy substrátu je prvním faktorem, který je třeba zvážit, nutná míra kontrastu mezi cílem a vzorkem tkáně. Některé tkáně, jako je například melanom, jsou přirozeně pigmentované nebo mají hnědé či černé vrstvy. V takové situaci je naprosto zásadní použít substrát s vynikajícím kontrastem, aby se zabránilo falešně pozitivní interpretaci. V případě použití jakéhokoliv kontrastního barviva je třeba zvážit také jeho barvu.

Dosažení kontrastu je nezbytné také v případě dvojitého barvení. Pokud si například pro jeden antigen vyberete červený substrát, pro druhý cíl by bylo vhodné zvolit třeba modrý substrát. Mějte však na paměti, že některé substráty nejsou navzdory svým kontrastním barvám kompatibilní, případně se v rámci pracovního postupu musí aplikovat v určitém pořadí. Substrát Vector Blue je kompatibilní se substrátem Vector Red za předpokladu, že Vector Blue je použit ke značení antigenu jako první.

Pokud se o problematiku zajímáte více do hloubky, kompletního průvodce kompatibilitou mezi enzymovými substráty v angličtině naleznete v tomto IHC Multiplexing Guide od společnosti Vector Laboratories.

Citlivost

Různé substráty se liší svou citlivostí, která umožňuje ještě větší flexibilitu a míru kontroly při navrhování experimentů. Vyšší citlivost umožňuje lepší detekci nízce abundantních proteinů. K odlišné citlivosti povede také různé složení téhož substrátu. K dosažení maximální citlivosti je vhodné z nabídky společnosti Vector Laboratories zvolit substráty ImmPACT a upřednostnit je před ostatními nabízenými substráty.

Využívání vysoce citlivých substrátů může časem vést k úspoře nákladů.

Výběr enzymových substrátů s vysokou citlivostí může z dlouhodobého hlediska potenciálně snížit náklady. Obrázek níže ukazuje, že i osminásobné naředění primární protilátky vykazuje dostatečnou intenzitu zabarvení. Další výhodou některých substrátů je vyšší citlivost při delší inkubační době. Například AP substrát BCIP/NBT umožňuje inkubační dobu až 24 hodin.

 

ImmPACT DAB, jeden z nejcitlivějších substrátů společnosti Vector Laboratories, vykazuje dostatečnou intenzitu zabarvení i při osminásobném naředění primární protilátky.

 

Vizualizace

I když jsou všechny enzymové substráty s mikroskopy pro pozorování v jasném poli kompatibilní, vaše možnosti může omezit zvolená metoda vizualizace. Spektrální zobrazování nabízí rozmanitost a flexibilitu, protože Vector Black je jediným substrátem, který není s touto zobrazovací technikou kompatibilní. I při použití tmavého pole nebo elektronové mikroskopie máte stále na výběr z nejméně 10 různých HRP substrátů. Nejmenší počet možností – čtyři AP substráty – pak nabízí fluorescenční mikroskopie.

Odolnost vůči teplu

Některé způsoby imunobarvení mohou jako jeden z kroků protokolu vyžadovat zahřátí vzorku. Zahřátí může být například nezbytné pro odmaskování antigenu při IHC nebo pro denaturaci DNA při hybridizaci in situ. Při uplatnění protokolů, které vyžadují zahřátí vzorku, použijte vždy nejprve tepelně odolný substrát. Společnost Vector Laboratories pro tyto případy nabízí tři substráty na bázi HRP a čtyři substráty na bázi AP.

Dotek vaší osobnosti

Po stanovení a splnění technických požadavků konkrétní IHC aplikace vám stále může zůstat na výběr několik možností různých barevných odstínů. A zde máte příležitost dodat mikrosnímku punc vlastní osobnosti a vybrat si svou oblíbenou barvu. Možná budete nakonec na svůj mikrosnímek tak pyšní, že si ho zarámujete a pověsíte na zeď.

Společnost Vector Laboratories nabízí celkem 18 sad substrátů pro IHC aplikace – 13 pro systémy na bázi HRP a 5 pro systémy na bázi AP. Tato škála odpovídá celkem 9 barevným odstínům pro barvení jednoho antigenu a 42 kombinacím v případě barvení dvou antigenů. Vybrat si z tolika různých možností je náročné, ale vezmete-li v úvahu své konkrétní potřeby (enzym, barvu, citlivost, vizualizaci a odolnost vůči teplu), pomůže vám to přesně určit a vybrat to nejvhodnější řešení.


Ať vám jde barvení od ruky!

 

(Převzato ze zahraničního zdroje, redakčně upraveno.)

Incucyte® – Využijte analýzu živých buněk uvnitř vašeho inkubátoru

Incucyte® – Využijte analýzu živých buněk uvnitř vašeho inkubátoru

Seznamte se s platformou Incucyte společnosti Sartorius a zjistěte, ve které variantě by byl nejvhodnější pro Vaši laboratoř!

více informací
Workshop a prezentace přístrojů Sartorius – Praha a Hradec Králové

Workshop a prezentace přístrojů Sartorius – Praha a Hradec Králové

Srdečně Vás zveme na workshop a prezentaci Sartorius Octet N1 v pondělí 7.11.2022 v Hradci Králové a workshop a prezentaci Incucyte a Octet ve středu 9.11.2022 v Praze.

více informací
Představujeme Corning® Lambda™ EliteMax, poloautomatický stolní pipetor

Představujeme Corning® Lambda™ EliteMax, poloautomatický stolní pipetor

Stolní pipetor Corning Lambda EliteMax Benchtop Pipettor je poloautomatický, cenově dostupný a snadno použitelný manipulátor kapalin pro laboratorní stoly, které jsou omezené na prostor, ale vyžadují výkon a schopnost provádět vysokokapacitní screeningy pro velké objemy testů. Více se dočtete v následujícím textu.

více informací