Za ideálních okolností není na povídání si s kamarádkou nic obtížného ani složitého. Ale v intenzivním prostředí, jako je třeba hlučný večírek, do bezprostřední komunikace často vstupují konkurenční zvuky, které vaši řeč přehluší nebo zhorší její srozumitelnost. K předání sdělení pak musíte nalézt způsob, jak hluk na pozadí překonat. Vědci, kteří provádějí testy založené na detekci protilátek a na závěr složitého barvicího protokolu analyzují výsledky, se potýkají s podobným problémem. Aby dokázali určit, zda vidí skutečný výsledek, potřebují odblokovat externí „šumy“ a zaměřit se na specifický signál.
Přestože je samotná technika imunohistochemie (IHC) běžná, výzkumníci se s ní často potýkají kvůli složitosti biologických vzorků. Při provádění IHC se vědci pokoušejí redukovat vyšší pozadí či nespecifické zabarvení vzorku. Nechtěným signálem může být celkově slabší zabarvení tkáňového řezu, nebo naopak intenzivnější zabarvení, které se jeví jako specifické a vede k falešně pozitivním výsledkům.
Pro jednoznačnou detekci je potřeba, aby se protilátky vázaly specificky na své cíle a k precipitaci detekčního substrátu docházelo pouze v místě antigenů s navázanými protilátkami. Specifickou interakci mezi protilátkou a antigenem však může často překrýt nespecifická vazba protilátek na tkáňové elementy, jako jsou nabité částice, makromolekuly či Fc receptory, nebo endogenní enzymatická aktivita. Blokováním zdrojů nespecifických signálů lze zvýšit poměr signálu k šumu, a optimalizovat tak výsledky.
Proteinové blokátory
Významným zdrojem nespecifického signálu jsou mezimolekulární síly, které podněcují vazbu protilátek na jiné molekuly ve vzorku. Tomu se výzkumníci snaží ještě před přidáním primární protilátky vyhnout přimísením blokovacích činidel na bázi proteinů, jimiž se tato nespecifická vazebná místa nasytí. V závislosti na volbě blokovacího činidla pak obsažené proteiny brání vzniku nespecifické vazby buď na hydrofobní oblasti proteinového řetězce nebo na Fc receptorech v tkáni. Teoreticky může být blokátorem nežádoucí interakce kterýkoli protein, který se specificky na zájmový epitop neváže.
Jedním z běžných proteinových blokátorů je normální sérum odebrané ze zdravých zvířat. Sérum obsahuje protilátky, které se nespecificky vážou na Fc receptory a blokují tak interakci primárních protilátek. Sérum by mělo pocházet ze živočišných druhů, z nichž byla získána sekundární protilátka, nikoli ze živočichů, od nichž pochází primární protilátka. Tím je zajištěno, aby se sekundární protilátky nevázaly na blokátor a nezvyšovaly signál pozadí.
K proteinovým blokátorům často používaným ve výzkumu patří hovězí sérový albumin (BSA) a odtučněné sušené mléko. Proteiny BSA a odtučněného sušeného mléka fyzicky obsadí vazebná místa, která mají tendenci ke vzniku nespecifických vazeb s protilátkami v důsledku elektrostatických či iontových interakcí. Protilátka specifická pro daný cílový antigen by neměla vykazovat vyšší afinitu pro nespecifická vazebná místa než příslušný proteinový blokátor. Jednou z výhod této metody je, že odpadá nutnost brát v úvahu zdroj proteinů ve vztahu k primárním nebo sekundárním protilátkám.
“Animal free” blokátory jsou univerzální blokovací činidla a ředidla vhodná pro výzkumníky, kteří se snaží vyhýbat proteinům živočišného původu. Tyto reagencie mohou být alternativou séra, BSA, kaseinu či odtučněného sušeného mléka pro řadu využití včetně IHC, blotování nukleových kyselin a blotování proteinů.
Enzymatická blokovací činidla
Metoda chromogenní detekce využívá enzymu konjugovaného se sekundární protilátkou k vazbě na primární protilátku navázanou na cíl. U nejpoužívanějších detekčních substrátů pro IHC dochází k interakci s protilátkami konjugovanými s křenovou peroxidázou (HRP) a alkalickou fosfatázou (AP). Tyto enzymy jsou však již přítomny v některých tkáních, kde reagují s detekčním substrátem a způsobují signál pozadí. Ke zhášení aktivity enzymů je ještě před detekcí třeba přidat činidla, která blokují enzymy. Výzkumníci často provádějí tuto blokaci ještě před inkubací primární protilátky.
V ledvinách, játrech a tkáních obsahujících červené krvinky se obzvláště často vyskytuje peroxidáza. Výzkumníci často zhášejí endogenní peroxidázu pomocí peroxidu vodíku. Prostým kápnutím chemikálie rozpuštěné ve vodě, fosfátovém pufru či metanolu na sklíčka s preparáty dojde k reakci, jež následně inaktivuje enzym a rozloží peroxid vodíku na kyslík a vodu. Je-li tkáň bohatá na peroxidázu, mohou vodné roztoky peroxidu vodíku zničit základní tkáňovou architekturu. V takovém případě by byl vhodnějším rozpouštědlem metanol.
Pokud detekční substrát reaguje s alkalickou fosfatázou, mohou výzkumníci blokovat aktivitu endogenních enzymů roztokem levamisolu. V tomto případě by se blokátor neměl použít před přidáním primární protilátky, ale roztok levamisolu by se měl do roztoku substrátu alkalické fosfatázy přidat až těsně před detekcí.
Mnoho výzkumníků pak dává přednost tzv. “ready-to-use” blokovacím roztokům endogenních enzymů, protože jde o hotový produkt k okamžitému použití. Bývá u nich krátká inkubační doba a bývají kompatibilní s tkáňovými řezy fixovanými formalínem a zalitými do parafínu, zmrazenými tkáňovými řezy a buněčnými preparáty. Některé inaktivují jak endogenní peroxidázu, tak alkalickou fosfatázu.
Obrázek 1: Příklad ready-to-use blokátoru. Aktivita endogenní alkalické fosfatázy (AP) a peroxidázy (HRP) v řezu zmrzlé tkáně střeva fixované acetonem zobrazená pomocí AP substrátu (purpurová) a HRP substrátu (hnědá), (vlevo). Stejné substráty použité v tkáních ošetřených ready-to-use blokovacím roztokem (vpravo). Blokovací roztok zcela eliminuje aktivitu obou endogenních enzymů.
Citlivost IHC zlepšují detekční systémy na bázi biotinu v kombinaci s peroxidázou nebo alkalickou fosfatázou. Avidin- nebo streptavidin-biotinylované enzymové komplexy pevně vážou biotinylované protilátky. Biotin je však přítomen v mnoha tkáních a může generovat signál pozadí. Blokování nekonjugovaným avidinem/streptavidinem a poté biotinem způsobuje blokování endogenního biotinu, biotinových receptorů i vazebných míst pro avidin.
Volba správné strategie
Neexistuje jediná účinná strategie blokování proteinů použitelná pro všechna imunohistochemická vyšetření, a proto je vždy důležité provádět průběžně kontrolní testy. Výzkumníci musí při volbě nejvhodnějších blokovacích činidel zvážit cílové protilátky, typ tkáně a detekční činidla. Řezy ze stejného vzorku se mohou chovat odlišně s ohledem na rozdíly ve tkáni či typu buněk vykazujících odlišná vazebná místa a enzymy.
Aby se předešlo případným problémům a identifikoval se zdroj pozadí, měli by vědci nejprve vynechat primární protilátku a zjistit, zda nedochází ke generování nespecifického signálu. Pokud ano, mohou upravit dobu promývání, zkontrolovat zkříženou druhovou reaktivitu nebo zkusit jiná proteinová blokační činidla a pufry. Provedením těchto kroků zaměřených na prevenci problémů mohou výzkumníci stanovit podmínky, které přinesou nejlepší výsledky IHC.
(Převzato od společnosti Vector Laboratories, redakčně upraveno.)