Jak si připravit vzorek na imunofluorescenční mikroskopii

Autoři: Florian Hoff & Philipps University Marburg, Institute of Cytobiology and Cytopathology, Německo

 

Imunofluorescence (IF) je účinná metoda pro vizualizaci intracelulárních procesů, stavů a struktur. IF preparáty lze analyzovat různými mikroskopickými technikami (např. konfokální mikroskopií, epifluorescencí, TIRF, GSDIM) v závislosti na aplikaci nebo zájmech výzkumníka. Mezitím se IF stala nezbytnou pro velké množství výzkumných skupin, které mají přístup alespoň k jednoduchému fluorescenčnímu mikroskopu.

Středobodem experimentu IF je kombinace dvou různých složek:

Tou první jsou specifické protilátky, které se používají k vytvoření imunokomplexu k označení požadovaných molekul – ve většině případů proteinů – v buňce.

Druhou složkou jsou fluorochromy, které jsou navázány na imunokomplexy, a vizualizují tak cílové struktury během mikroskopie.

Obr. 1: Toto schéma ilustruje typický pracovní postup nepřímé IF s epiteliálními buňkami, které rostou přichycené na krycích sklíčkách. Po kultivaci se buňky fixují, a tedy i usmrcují chemickým síťovacím činidlem (např. formaldehydem). Dále se provádí permeabilizační krok s detergenty, aby se umožnilo protilátkám procházet buněčnými membránami. Blokování pomocí normálního séra, mléčného prášku nebo hovězího sérového albuminu snižuje nespecifickou vazbu protilátek na necílové struktury, aby se minimalizovaly falešně pozitivní signály. Dále probíhá inkubace s primární protilátkou, která specificky rozpoznává epitopy na cílové molekule. Ve druhém inkubačním kroku se aplikuje fluorescenčně značená sekundární protilátka, která se váže na primární protilátku, a díky tomu vizualizuje cílovou strukturu. Po inkubaci protilátek se barvení jader provádí barvivy, jako je DAPI nebo Hoechst, které jsou vmezeřeny do DNA. Po kroku montování krycího sklíčka s montážním médiem (např. VECTASHIELD® PLUS a VECTASHIELD® Vibrance™) na podložní sklíčko je IF preparát připraven k mikroskopii.

 

Přímá vs. nepřímá imunofluorescence

V závislosti na typu experimentu existují dvě různé varianty IF. V přímé neboli primární IF se pro navázání na cílovou strukturu a její přímou vizualizaci používá specifická primární protilátka, na kterou je navázán fluorochrom.

Ve druhé variantě, označované jako nepřímá nebo sekundární IF, se provádí dvoustupňová inkubace. Nejprve specifická primární protilátka rozpoznává cílovou strukturu. Poté se aplikuje sekundární protilátka spojená s fluorochromem, která se specificky váže na primární protilátku. Tato specificita je zajištěna vybráním sekundární protilátky proti druhu, ve kterém byla primární protilátka vytvořena. Při porovnání dvou variant IF má každá z nich různé výhody a nevýhody.

Spojením primární protilátky s fluorochromem je přímá IF rychlejší než nepřímá verze, protože jsou vynechány časově náročné promývací a inkubační kroky. S přímou IF je tedy snazší manipulace, a proto je vhodná pro rychlou analýzu vzorků ve standardizovaných experimentech s IF, například v klinické praxi. Je však nezbytné použít dobře fungující primární protilátku s vysokou afinitou k jejímu antigenu. To je současně negativní aspekt, protože validované primární protilátky s vázaným fluoroforem jsou drahé. Kromě toho potřebujete samostatnou primární protilátku pro každou cílovou strukturu a propojení protilátky s fluorochromem v přímém IF omezuje vaši flexibilitu při navrhování experimentu ve srovnání s nepřímou IF.

Tato flexibilita je významnou výhodou nepřímé IF. Obvykle je třeba během jedné IF reakce vizualizovat několik různých cílových struktur ve stejném vzorku, proto musí být pro každou cílovou molekulu vybrán samostatný fluorochrom. V nepřímé IF lze různé sekundární protilátky spojené s fluorescenčními značkami kombinovat s různými primárními protilátkami (samozřejmě s ohledem na druhovou reaktivitu). Naproti tomu, pokud si chcete „hrát“ s barevnými kombinacemi vašich cílových struktur v přímé IF, potřebujete pro každou barvu samostatnou primární protilátku. Další výhodou nepřímé metody je amplifikace signálu sekundární protilátkou. Několik molekul sekundárních protilátek se může vázat na jednu primární protilátku, což vede ke zvýšení fluorescence, což znamená, že stačí aplikovat méně primární protilátky.

Pracovní postup nepřímé IF může trvat déle. Vzhledem k možné kombinaci primárních a sekundárních protilátek a obecně ekonomičtějšímu postupu je však pro většinu výzkumných pracovníků častější volbou.

Obr. 2: Existují dva způsoby, jak vizualizovat cílovou strukturu pomocí imunofluorescence. V obou variantách se používá specifická primární protilátka k rozpoznání konkrétního epitopu na cílové molekule. Zde se cílová molekula skládá z několika identických proteinových podjednotek (= makromolekula), a proto vykazuje na každé podjednotce několik epitopů stejného typu. Pro zjednodušení je zde znázorněn pouze jeden epitop.

V přímé IF je první protilátka přímo spojena s fluorochromem, který vizualizuje cílovou strukturu pod mikroskopem.

V nepřímé IF se během druhého inkubačního kroku aplikuje sekundární protilátka spojená s fluorescenční značkou, která specificky označuje primární protilátku. To vede k vyšší flexibilitě při výběru protilátek a fluorochromů a dále k zesílení signálu, protože několik sekundárních molekul protilátek se může vázat na jednu primární protilátku.

 

Protilátky a fluorochromy

Nejdůležitějším nástrojem pro vysoce kvalitní IF barvení je dobrá primární protilátka. Pro takřka každý protein v téměř každém typu buňky je k dispozici jedna nebo dokonce několik komerčně dostupných protilátek. Zde je však třeba poznamenat několik nesmírně důležitých věcí.

Chcete-li udělat přesné vědecké nebo klinické prohlášení založené na vašem IF barvení, musíte zajistit specificitu vaší primární protilátky vůči cílovému antigenu. Přitom byste se neměli spoléhat výhradně na prohlášení vašich komerčních poskytovatelů. Vyberte si protilátku podle již použitých a ověřených primárních protilátek v literatuře na toto téma. V datovém listu protilátky na webu výrobce vyhledejte dostupné obrázky IF barvení a porovnejte je s vašimi očekáváními nebo jinými publikovanými ilustracemi. Všimněte si klonality protilátky, protože monoklonální protilátky se specificky vážou pouze na jeden epitop, zatímco polyklonální protilátky rozpoznávají několik epitopů, což zvyšuje pravděpodobnost nespecifického značení necílených struktur. Proto jsou monoklonální protilátky s vysokou specificitou a dobrou afinitou obvykle dražší, ale dosahují také lepších výsledků.

Chcete-li provést vícebarevnou detekci u nepřímé IF, různé primární protilátky musí pocházet z různých druhů, aby bylo možné odlišit imunokomplexy následným značením sekundárními protilátkami s fluorescenční značkou (viz tabulka 1). Řekněme například, že provádíte IF s primární protilátkou vůči proteinu A odvozenou od myši, protilátkou  vůči proteinu B od králíka a protilátkou vůči proteinu C od krysy. Při výběru sekundárních protilátek musíte pamatovat na to, že každá z nich specificky rozeznává pouze jednu primární protilátku. Kromě toho se fluorochromy v tomto příkladu tří sekundárních protilátek musí lišit ve svém spektru vlnových délek k rozlišení jejich fluorescenčních signálů v mikroskopické analýze. V dnešní době je možné zakoupit sekundární protilátky spojené s fluorochromy s rozsahem vlnových délek od ultrafialového po infračervený a proti primárním protilátkám téměř jakéhokoliv druhu. Výzkumník je tedy omezen pouze konfigurací dostupných mikroskopů (sady filtrů, excitačních laserů).

Cílový proteinProtein AProtein BProtein C
Cílový druhČlověkČlověkČlověk
Primární protilátkaproti proteinu Aproti proteinu Bproti proteinu C
Druhová reaktivita primární protilátkymyší proti lidskému proteinukráličí proti lidskému proteinukrysí proti lidskému proteinu
Druhová reaktivita sekundární protilátkykozí proti myšímu proteinu (protilátce)kozí proti králičímu proteinu (protilátce)kozí proti krysímu proteinu (protilátce)
Excitační/emisní vlnová délka fluorochromu490/525 nm556/573 nm650/665 nm

 

 

Překryv

Protein A

Protein B

Protein C

Tab. 1: Tento příklad vícebarevné nepřímé IF ukazuje, jak současně označit tři různé proteiny ve stejné buňce. Tři primární protilátky musí pocházet z různých druhů, aby je bylo možné detekovat třemi různými sekundárními protilátkami spojenými s fluorochromy. Fluorochromy sekundárních protilátek se musí pro jejich odlišení v mikroskopu lišit ve spektru vlnových délek. Buňka zobrazená na vzorovém obrázku byla také ošetřena Hoechst 33342 pro obarvení jádra. Mikroskopie byla prováděna na Leica TCS SP2.

 

Vzorek

IF protokoly existují pro řadu různých typů vzorků. Nejjednodušší a nejčastěji používanou metodou je barvení kultivovaných (eukaryotických) buněk z buněčné kultury. Adherentně rostoucí buňky mohou být naočkovány na krycí sklíčka, vícejamkové inserty nebo přímo na kultivační misky se skleněným dnem a použity pro IF v požadovaném čase. IF je také možná se suspenzními buňkami po aplikaci buněk na sklíčko objektu, např. cytospinem (cytocentrifuga). V obou případech se pozornost zaměřuje na analýzu intracelulárních procesů nebo struktur, což se nazývá imunocytochemie (ICC).

V imunohistochemii (IHC) se naopak přítomnost proteinů nebo molekul zkoumá v tkáňově specifickém kontextu. Zde jsou ultratenké řezy orgánových preparátů (obvykle zalité v parafínovém vosku) používané např. pro zkoumání exprese proteinů ve zdravém orgánu ve srovnání s nemocným. Kromě přípravy tkáňových řezů je také možné provádět IF s celými organismy, což je proces označovaný jako „whole mount IHC“. Za tímto účelem se používají embrya různých modelových organismů, jako je například myš, kuře nebo zebřička (Danio rerio), nebo rostlinné modelové organismy, jako je huseníček (Arabidopsis thaliana). Whole mount IHC skýtá omezení ve velikosti vzorku a s tím spojenou hloubkou průniku IF činidel. Samotné inkubační kroky trvají déle než barvení kultivovaných buněk. Rovněž musí být k dispozici mikroskopy se speciálním optickým zařízením pro analýzu velkých vzorků.

Obr. 3 a) Imunohistochemické barvení (IHC) lidské ledviny zobrazuje různé buněčné typy v různých strukturách (např. glomerulus, proximální tubulus, distální tubulus). Exprese proteinu značeného zeleným fluorochromem je omezena na konkrétní buněčný typ, zatímco červeně značený protein je exprimován široce.

Obr. 3 b) Obrázek Immunocytochemie (ICC) ukazuje barvení dvou proteinů v buňkách stejného typu (MDCK) nepřímou IF. Zde není možná tkáňově specifická studie, ale analýza, zda se oba proteiny kolokalizují ve stejné struktuře. Oba vzorky byly ošetřeny Hoechst 33342 pro obarvení jader. Mikroskopie byla provedena na Leica TCS SP2.

Promývací krok

Během postupu IF je potřeba věnovat zvláštní pozornost promývacím krokům Kvalitu IF lze totiž zvýšit právě správným promýváním. PBS je standardní promývací pufr, zatímco převládající jsou také varianty jako PBS++ nebo PBS-T. PBS++ obsahuje 1 mM CaCl2 a MgCl2, o kterých se předpokládá, že mají membránu stabilizující účinek zabraňující oddělení buněk. Pro PBS-T se přidá detergent Tween 20 na konečnou koncentraci 0,05 % s cílem zvýšit vazebnou specificitu protilátek. Je nesmírně důležité nanášet a odsávat promývací pufr opatrně, aby nedošlo k oddělení buněk od kultivační nádoby nebo krycího sklíčka. Pokud máte dostatek času, nechejte mezi odsávacími kroky několik minut k promytí, abyste zajistili účinnou difúzi promývacího pufru do vzorku. Jednotlivé promývací kroky IF postupu jsou uvedeny v standardním protokolu níže.

Jednotlivé kroky konvenční IF reakce jsou popsány níže. Standardní protokol pro nejběžnější postup nepřímé IF s kultivačními buňkami je připojen na konec tohoto článku.

 

Fixace

Fixace je prvním krokem IF postupu. Cílem je udržovat buňky, buněčné formace nebo tkáně v jejich současném stavu a konzervovat vzorek chemickými činidly po delší dobu. Během fixace je důležité, aby buněčné struktury zůstaly pokud možno co nejvíce v nativní konformaci. Pro IF jsou užitečné různé metody fixace, přičemž každé činidlo má jiný účinek na epitopy rozpoznávané primární protilátkou. Vazebná místa pro protilátky mohou být maskována nebo také poškozena fixací, což zhoršuje kvalitu barvení IF. Jelikož se každá protilátka váže na svůj antigen odlišně v závislosti na různých fixačních sloučeninách, je nutné pro novou protilátku vyzkoušet několik metod fixace. Specifikace vhodného fixátoru jsou často uvedeny v datovém listu protilátky. Ideální fixace zachovává buněčnou a subcelulární strukturu a poskytuje neblokované antigeny pro dobrou vazbu protilátky. Ve skutečnosti mezi nimi musíte najít rovnováhu.

Fixační činidla lze zhruba rozdělit do dvou skupin: chemická síťovadla a organická rozpouštědla.

Chemická síťovací činidla, jako jsou formaldehyd, zesíťují proteiny prostřednictvím jejich volných aminoskupin; buněčná morfologie je ve většině případů dobře zachována. Antigeny jsou však také zesítěné, což může snížit vazbu protilátky. Glutaraldehyd má také konzervační účinek na buněčné struktury, ale má za následek vysokou autofluorescenci vzorku v mikroskopii (viz část Kontroly níže).

Organická rozpouštědla, jako je methanol nebo aceton, mají dehydrogenační účinek a precipitují proteiny, čímž je fixují v buněčném kontextu. Pamatujte však, že rozpustné molekuly a mnoho lipidových složek se v procesu ztrácejí. Často se používá kombinace methanolu a acetonu, protože i když je pro zachování buněčných struktur methanol nejlepší, má extrémně negativní dopad na mnoho epitopů. Aceton je zde méně škodlivý. Měli byste také zvážit, že fluorescenční proteiny, jako je GFP, které jsou již přítomny ve vašich buňkách, budou z velké části zničeny fixací organickými rozpouštědly. Pokud výrobce primární protilátky nenavrhne fixační prostředek, je vhodné pro různé buněčné linie a antigeny začít s 4% formaldehydem po dobu 10 minut při pokojové teplotě.

 

 

FixativumÚčinekVýhodyNevýhody
Chemická síťovací činidlaFormaldehydSíťování proteinů prostřednictvím jejich volných aminoskupin.Zachovává dobře buněčnou morfologii.

Dobré pro již přítomné fluorescenční proteiny.

Antigeny mohou být také zesíťovány.
GlutaraldehydZachovává dobře buněčnou morfologii.

Dobré pro již přítomné fluorescenční proteiny.

Antigeny mohou být také zesíťovány.

Vysoká autofluorescence.

Organická rozpouštědlaMethanolFixace dehydrogenací a srážením bílkovin.

Buňky budou současně permeabilizovány.

Dobré zachování buněčné architektury.

Rychlejší postup ve srovnání s chemickými síťovacími činidly.

Silný negativní účinek na mnoho epitopů.

Nevhodné pro fluorescenční proteiny.

Rozpustné a lipidové složky se ztrácejí.

AcetonMéně škodlivý pro epitopy.

Rychlejší postup.

Nevhodné pro fluorescenční proteiny.

Rozpustné a lipidové složky se ztrácejí.

Tab. 2: Fixační činidla.

 

Permeabilizace

Permeabilizací se intracelulární struktury stávají přístupnými pro protilátky, které jinak nejsou schopny procházet lipidovými membránami buňky. V závislosti na typu fixace je nezbytný samostatný krok permeabilizace. Při fixaci organickými rozpouštědly jsou buněčné membrány již propustné a můžete přímo pokračovat v blokování. Buňky fixované chemickými zesíťujícími prostředky vyžadují pro permeabilizaci další ošetření detergentem. Používají se klasické detergenty jako Triton X-100 nebo NP-40, ale lze použít i saponin, tween 20 nebo digitonin. Opět, lze získat různé výsledky v závislosti na aplikované látce, její koncentraci a inkubační době, takže byste měli na začátku vyzkoušet různé parametry. Typický start představuje permeabilizace s 0,1% Tritonem X-100 v PBS po dobu 15–20 minut při pokojové teplotě.

Pokud chcete analyzovat membránové nebo jinak s lipidy spojené proteiny pomocí IF, měli byste pečlivě provést krok permeabilizace (= odstranění lipidů). Dobrou volbou pro tento účel je saponin, který selektivně odstraňuje cholesterol z plazmatické membrány a zanechává intracelulární membrány z velké části nedotčené. Pokud je permeabilizace před barvením protilátek vynechána (možné pouze fixací chemickými esíťovacími činidly), můžete specificky označit antigeny vázané na extracelulární plazmatickou membránu, abyste je odlišili od intracelulárních antigenů. Barviva nukleových kyselin, jako je DAPI nebo Hoechst, jsou propustná pro membránu a nevyžadují permeabilizaci.

 

Blokování

Blokování je důležitým krokem pro minimalizaci nespecifické vazby primární protilátky v buňce. K dosažení tohoto cíle lze použít bílkoviny z hovězího sérového albuminu (BSA), sušeného mléka nebo séra. Je důležité, aby tyto blokovací proteiny nepocházely z druhů, ve kterých byla primární protilátka vytvořena, jinak by došlo ke ztrátě specificity sekundární protilátky vůči primární protilátce. Pokud používáte sekundární protilátku vyrobenou např. v koze proti primární myší protilátce, je ideálním blokovacím činidlem normální kozí sérum. Blokovací roztoky se běžně používají v koncentracích 1% (sušené mléko, BSA) až 5% (normální sérum) a ředí se promývacím pufrem. Inkubace probíhá při pokojové teplotě po dobu 30–60 minut.

 

Imunoreakce

Po přípravě vzorku fixací, permeabilizací a blokováním nastává vlastní imunoreakce. Vzorky jsou nyní inkubovány se specifickou primární protilátkou k označení požadovaných cílových struktur. Na vzorek lze aplikovat více primárních protilátek současně. Jak bylo uvedeno výše, v tomto případě nepřímé vícebarevné IF detekce musí primární protilátky pocházet z různých druhů. Ředění protilátek se provádí ve vybraném blokovacím roztoku, zpočátku podle výrobce. Pokud nejste spokojeni se svým zabarvením nebo pokud výrobce neposkytne žádné informace o pracovním ředění, měli byste zkusit koncentrace mezi 1:50 až 1: 1 000. Inkubační doba se může lišit v závislosti na afinitě protilátky. Výchozí inkubační časy jsou 1–2 hodiny při pokojové teplotě; je také možná inkubace přes noc při 4 °C.

Pokud provádíte přímou IF, můžete přímo pokračovat v montování vzorku, protože primární protilátka již přináší svůj vlastní fluorochrom. V nepřímé IF sekundární protilátky nyní fluorescenčně značí primární protilátky. Rozhodujícím bodem je zde rozsáhlé promytí po inkubaci s primární protilátkou, aby se snížila nespecifická vazba sekundární protilátky. Sekundární protilátka může být také naředěna v blokujícím roztoku nebo promývacím pufru. Pokud není výrobcem uvedeno jinak, můžete začít s ředěním 1: 200 a inkubací po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Inkubační kroky je nutné provádět ve tmě, aby se zabránilo bělení fluorochromu.

 

Barvení jader a připojení vzorků

Po imunoreakci často následuje obarvení jádra barvivy specifickými k DNA. Na jedné straně to umožňuje lepší orientaci v buněčných nebo tkáňových řezech během mikroskopie a na druhé straně to indikuje buněčný stav (např. mitózu), pokud to výzkumníka zajímá. K tomu se používají barviva jako Hoechst nebo DAPI, která vstupují do jádra i bez permeabilizace a interkalují do DNA. Z tohoto důvodu byste měli být velmi opatrní, abyste zabránili přímému kontaktu pokožky s těmito barvivy! Jednoduché jaderné barvení Hoechstem nebo DAPI naředěnými v PBS probíhá 10 minut při pokojové teplotě. Velmi oblíbená jsou montovací média s těmito kontrastními barvivy, která tento krok usnadňují.

Po dokončení postupu IF musí být vzorky montovány tak, aby byly vhodné pro mikroskopii. K tomuto účelu se používá montovací médium (např. VECTASHIELD® PLUS a VECTASHIELD® Vibrance™), které fixuje vzorek na podložním sklíčku mikroskopu a také zabraňuje jeho dehydrataci. Kromě toho montovací média zvyšují index lomu, což je příznivé pro mikroskopii s olejovými imerzními objektivy. Několik výrobců nabízí montovací média s přísadami proti vyblednutí, který chrání vzorek před fotobělením. V závislosti na použitých fluorochromech jsou některá činidla proti vyblednutí účinnější než jiná. Kromě toho je také k dispozici montovací médium s přidanými DNA barvivy, takže jádra jsou obarvena během zamontování a samostatné barvení jader je nadbytečné. Pokud se používá tvrdnoucí montovací médium, což je častý případ, nechá se vzorek v závislosti na výrobku vytvrdnout (obvykle 20-60 minut), takže je mikroskopické vyšetření možné téměř ihned. Trvalé preparáty vyrobené tímto způsobem lze prakticky neomezeně skladovat ve tmě při pokojové teplotě nebo 4 °C, nezapomeňte však, že intenzita fluorescence fluorochromů se časem snižuje.

Obr. 4: Adherentně rostoucí epiteliální buňky (MDCK) byly kultivovány na krycích sklíčcích, fixovány a jádra byla obarvena pomocí Hoechst 33342. Většina buněk vykazuje barvení interfáze DNA, některé buňky však vykazují kondenzované chromozomy, které se oddělují v mitóze (hvězdičky). Mikroskopie byla provedena na Leica TCS SP2.

Obr. 5: Tento obrázek ukazuje nepřímé IF barvení buněčné sítě mikrotubulů ve fibroblastové buňce (COS-7). Jádro bylo obarveno Hoechst 33342 a mikroskopie byla provedena na Leica TCS SP2.

 

Kontroly

Pro imunofluorescenci jsou nezbytné vhodné kontroly pro správnou interpretaci vašich mikroskopických obrazů. Chybějící nebo nesprávné kontrolní prvky obvykle vedou k falešně pozitivním výrokům a nesprávným údajům. Nejprve byste měli analyzovat vzorek, který byl pouze fixován, permeabilizován a blokován, abyste získali představu o autofluorescenci buněčných kompartmentů. Struktury se někdy jeví jako vysoce fluoreskující, přestože neproběhlo zbarvení pomocí IF.

Jako další kontrola a také pro nastavení parametrů mikroskopu pro nepřímou IF se použije vzorek, který byl ošetřen stejně, jak je popsáno výše, ale který byl navíc inkubován se sekundární protilátkou (protilátkami). Nejprve by to odhalilo silnou nespecifickou vazbu sekundární protilátky na vzorek. Zadruhé jsou parametry mikroskopu nastaveny tak, aby se během pořizování obrazu této kontroly nezaznamenával žádný signál. Toto nastavení se používá jako prahová hodnota pro následné akvizice k vyloučení falešně pozitivních signálů sekundární protilátkou. V přímé IF slouží autofluorescenční kontrola k nastavení prahu. Dále analyzujte vzorky, které byly inkubovány se specifickou primární protilátkou a v případě nepřímé IF také se sekundární protilátkou. Zde by měl být nyní detekovatelný fluorescenční signál, který je intenzitou nad autofluorescencí a negativní kontrolou sekundární protilátky.

Aby bylo zajištěno, že primární protilátka značí výhradně požadované struktury, nabízejí někteří výrobci blokující peptid pro primární protilátku, který maskuje specifický antigen, čímž brání vazbě protilátky na svůj epitop. To je sice dražší, ale zato nejlepší způsob, jak určit specificitu protilátky a získat tak spolehlivé výsledky. V IF experimentu s vícebarevnou detekcí musíte také věnovat pozornost interferenci (tzv. crosstalku) mezi vybranými fluorochromy. Pokud provádíte vícebarevnou IF poprvé, je vhodné dodatečně obarvit cílové struktury v samostatných přípravách a porovnat tyto obrazy s vícebarevným obrazem. Nakonec byste se měli kriticky podívat na svá získaná data a porovnat je s vašimi očekáváními a existujícími daty o stejné primární protilátce.

 

 

KontrolaPříprava vzorkuUžitečné pro
Autofluorescence●       Fixace

●       Permeabilizace

●       Blokování

 

Analýza buněčné autofluorescence.

Prahová hodnota pro mikroskopii v přímé IF.

Sekundární protilátka (pouze nepřímá IF)●       Fixace

●       Permeabilizace

●       Blokování

●       Sekundární protilátka

●       (V případě potřeby: barvení jádra)

Nespecifická vazba sekundární protilátky.

Prahová hodnota pro mikroskopii v nepřímé IF.

IF s vícebarevnou detekcí●       Fixace

●       Permeabilizace

●       Blokování

●       Pouze 1 první protilátka

●       (Nepřímá IF: sekundární protilátka)

●       (V případě potřeby: barvení jádra)

Porovnejte jednotlivá barvení s vícebarevným obrázkem:

●       Zkontrolujte interferenci vybraných fluorochromů.

●       Zkontrolujte, zda se primární protilátky navzájem ovlivňují ve vazbě na epitop.

Blokující peptid●       Fixace

●       Permeabilizace

●       Blokování

●       Blokující peptid

●       Primární protilátka

●       (Nepřímý IF: sekundární protilátka)

●       (V případě potřeby: barvení jádra)

 

Kontrola vazebné specificity primární protilátky na cílový epitop.

Tab 3: Kterou kontrolou co otestovat?

 

Omezení

Jak již bylo dříve popsáno, IF má mnoho výhod, ale přináší s sebou také některé nevýhody. Klíčovým bodem je fixace vzorku: fixace znamená zabití, takže zobrazování živých buněk již není možné. Analýza dynamických procesů je proto komplikovaná, protože pro každý časový bod musí být buňky fixovány a obarveny. U IF tedy nelze pozorovat rychlé dynamické procesy. To je zjevně výhoda exprese fúzních proteinů s fluorescenčními značkami, jako je GFP, které jsou vhodné pro zobrazování živých buněk. Jak již bylo zmíněno výše, procedura IF (fixace / permeabilizace) mění buněčnou stavbu, takže artefakty mohou být interpretovány jako falešně pozitivní signály. Je proto nezbytné připravit správné kontroly pro každé IF barvení, což může být časově náročné. Další nevýhoda je nevyhnutelná: fotobělení fluorochromů. Tím jsou ovlivněny také fluorescenční proteiny, jako je GFP, ale při správném skladování je ve stálých preparátech GFP detekovatelný i po měsících. Naproti tomu IF fluorochromy ztrácejí svou intenzitu rychleji, což se projevuje rychlým vybělením vzorku během mikroskopie. I montážní média s prostředky proti vyblednutí zde mohou pomoci pouze dočasně.

Obr.6: Vývojový diagram celého postupu.

 

Standardní IF protokol

Doba trvání IF postupu: cca. 5 hodin.

Jedná se o standardní protokol pro nepřímou IF kultivovaných buněk na krycích sklíčcích s fixací chemickými síťovadly.

Zvlhčovací komůrka je ideální pro IF postup a lze ji snadno vyrobit svépomocí (viz prezentace „Jak připravit zvlhčovací komůrku“ níže). Zabraňuje vysychání preparátu a umožňuje inkubaci ve tmě, což je důležité při manipulaci s fluorochromy a nezbytné pro již existující fluorescenční proteiny.

Objemy jsou voleny tak, aby byla krycí sklíčka zcela navlhčená. Ujistěte se, že vzorek nikdy úplně nevyschne.

Všechny inkubační kroky probíhají při pokojové teplotě.

 

1. Buňky dvakrát omyjte a pomocí pinzety opatrně vložte krycí sklíčko s převrácenými buňkami do zvlhčovací komůrky.

2. Fixujte 4% formaldehydem po dobu 10 minut a promyjte 3x.

3. Permeabilizujte 0,1% TX-100 / PBS po dobu 15–20 minut a promyjte 3x.

4. Blokujte 5% normálním kozím sérem / PBS nebo 1% BSA / PBS po dobu 45 minut (není nutné promývání).

5. Nařeďte primární protilátku v blokujícím roztoku a aplikujte ji po 2 hodiny (nebo přes noc při 4 °C). Promyjte 4 × důkladně, abyste odstranili nenavázanou primární protilátku.

6. Inkubujte se sekundární protilátkou po dobu 1 hodiny, naředěnou v blokujícím roztoku nebo promývacím pufru.

7. Odsajte sekundární protilátku a pokud je to požadováno, inkubujte s Hoechst nebo DAPI [1 ug / ml] v PBS po dobu 10 minut. 4 × důkladně umyjte, a to i bez jaderného barvení.

8. Opatrně vezměte krycí sklíčko pinzetou a ponořte jej do destilované vody, abyste odstranili zbytky solí promývacího pufru.

9. Na mikroskopické sklíčko naneste kapku montážního média a položte krycí sklíčko s buňkami vzhůru nohama na tuto kapku. Mírně přitlačte vzorek pinzetou, aby bylo montovací médium dobře rozloženo, aniž byste vzorek museli mačkat.

10. Po vytvrzení je vzorek připraven k mikroskopii.

 

Prezentace: Jak připravit zvlhčovací komůrku 

1. Pro sestavení zvlhčené komory potřebujete následující předměty: plastovou krabičku s víkem, vložku z pěnového plastu, plátek parafilmu, robustní papírový ručník, vodu a pinzetu pro manipulaci s krycími sklíčky.

2. Vložte vložku do krabice a důkladně ji navlhčete.

3. Umístěte parafilm na vložku.

4. Opatrně přesuňte krycí sklíčka pinzetou z kultivační nádoby na parafilm s nahoru obrácenými buňkami. Označte polohy krycích sklíček a zajistěte, aby buňky nikdy nevyschly.

5. Navlhčete papírový ručník a těsně jej položte na krabici. Dbejte na to, aby se ručník nedotýkal krycích sklíček.

6. Nasaďte víko na krabici a ručník a inkubujte buňky po požadovanou dobu.

 

Roztoky – příprava

Promývací pufry

1 × PBS (fyziologický roztok fosfátového pufru)

               • 137 mM: NaCl

               • 2,7 mM: KCl

               • 10 mM: Na2HPO4

               • 1,8 mM: KH2PO4

Upravte pH na 7,2–7,4 pomocí HCl

Pro PBS++ přidejte CaCl2 a MgCl2 na konečnou koncentraci 1 mM

Pro PBS-T přidejte Tween 20 na konečnou koncentraci 0,05%

 

Fixační pufry

Formaldehyd:

               • 4% PFA (paraformaldehyd) se rozpustí v teplé (50–70 °C) dH2O při pH 8 (upraví se NaOH).

               • Přidejte 10 × PBS na konečnou koncentraci 1 × PBS (např. 100 ml 10 × PBS v 900 ml 4% PFA / dH2O).

               • Upravte pH na 7,2–7,4 pomocí HCl.

Methanol (předchlazený na –20 °C):

               • 100% methanol (–20 °C)

Methanol / Aceton (předchlazený na –20 °C):

               • 50 % methanolu (–20 °C) a 50 % acetonu (–20 °C)

 

Permeabilizační pufry

TX-100 (Triton X-100):

               • PBS s konečnou koncentrací 0,1 % TX-100

Saponin:

               • PBS s konečnou koncentrací 0,1 % saponinu

Ve stejné koncentraci lze v PBS použít i jiné detergenty.

 

Blokovací pufry

BSA (hovězí sérový albumin):

               • PBS s konečnou koncentrací 1 % BSA

Sušené mléko:

               • PBS s konečnou koncentrací 1 % sušeného mléka

Normální sérum:

               • PBS s konečnou koncentrací 5 % normálního séra

 

Nukleová barviva

Hoechst nebo DAPI:

               • Připravte roztok Hoechst 33342 nebo DAPI s konečnou pracovní koncentrací 1 ug / ml v PBS.

 

(Zdroj originálního textu: Leica Microsystems. Redakčně upraveno.)

Speciální akce na vybrané produkty společnosti Ray Biotech

Speciální akce na vybrané produkty společnosti Ray Biotech

Pokud u nás zakoupíte tři ELISA kity od společnosti Ray Biotech a použijete v objednávce slevový kód, třetí kit budete mít zdarma!

více informací
kategorie: imunologie
Protilátka měsíce – CD20 (klon L26) – myší monoklonální protilátka

Protilátka měsíce – CD20 (klon L26) – myší monoklonální protilátka

Antigen CD20 je neglykosylovaný fosfoprotein, který je exprimován na normálních a maligních lidských B buňkách a předpokládá se, že působí jako receptor během aktivace a diferenciace B buněk. Spolu s CD79a je CD20 jedním z nejdůležitějších markerů pro identifikaci novotvarů z B-buněk. Např. je CD20 exprimován ve velké většině případů B-buněčné leukémie/lymfomu.

více informací
Úvod do dekalcifikace

Úvod do dekalcifikace

Dekalcifikace popisuje techniku ​​odstraňování minerálů z kosti nebo jiné kalcifikované tkáně, aby bylo možné připravit kvalitní parafínové řezy, které si zachovávají všechny základní mikroskopické prvky. Dekalcifikace se provádí po důkladném zafixování vzorku a před rutinním zpracováním do parafínu. V tomto článku je popsána základní struktura kosti a jsou uvedeny technické možnosti pro přípravu řezů. Je zde diskutován postup pro dekalcifikaci a úspěšné monitorování procesu, a jsou také uvedeny některé oblíbené možnosti ve výběru reagencií.

více informací