Jak se vytvářejí ostrá zobrazení

(Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

 

Autoři: Ruedi Rottermann; Peter Bauer, Dipl. Geol.; Leica Microsystems

 

Hloubka ostrosti v mikroskopii

V mikroskopii je hloubka ostrosti často považována za empirický parametr. V praxi je určena korelací mezi numerickou aperturou, rozlišením a zvětšením. Možnosti nastavení moderních mikroskopů vytvářejí pro dosažení nejlepšího možného vizuálního dojmu optimální rovnováhu mezi hloubkou ostrosti a rozlišením – tedy dvěma parametry, které jsou teoreticky nepřímo korelované.

 

Praktické hodnoty pro vizuální hloubku ostrosti

V normách DIN / ISO je hloubka ostrosti na straně objektu definována jako „axiální hloubka prostoru na obou stranách roviny objektu, ve které lze objektem pohybovat bez zjistitelné ztráty ostrosti obrazu, zatímco polohy obrazové roviny a objektivu jsou zachovány“.

Standard však neposkytuje žádná vodítka, jak měřit detekční práh pro zhoršení zaostření. Autorem první publikace na téma hloubky ostrosti na základě vizuální zkušenosti byl Max Berek, který publikoval výsledky svých rozsáhlých experimentů již v roce 1927. Berekův vzorec udává praktické hodnoty vizuální hloubky ostrosti, a proto se používá dodnes. Ve své zjednodušené podobě zní následovně:

TVIS = n [λ / (2 × NA²) + 340 µm / (NA × MTOT VIS)]

TVIS: Hloubka ostrosti na základě vizuální zkušenosti

n: Index lomu média, ve kterém je objekt umístěn. Pokud je objekt posunut, je do rovnice zadán index lomu média, které tvoří měnící se pracovní vzdálenost.

λ: Vlnová délka použitého světla, pro bílé světlo: λ = 0,55 µm

NA: Numerická apertura na boku objektu

MTOT VIS: Celkové vizuální zvětšení mikroskopu

 

Pokud je ve výše uvedené rovnici celkové vizuální zvětšení nahrazeno vztahem užitečného zvětšení (MTOT VIS = 500 až 1 000 x NA), je vidět, že při první aproximaci je hloubka pole nepřímo úměrná druhé mocnině numerické apertury.

Obr. 1: Hloubka pole jako funkce NA pro λ = 0,55 µm a n = 1

 

Zejména při malém zvětšení lze hloubku ostrosti významně zvýšit zastavením, tj. zmenšením numerické apertury. To se obvykle děje s aperturní clonou nebo clonou v konjugované rovině. Čím menší však numerická apertura je, ​​tím nižší je boční rozlišení.

 

Jde tedy o nalezení optimálního vyvážení rozlišení a hloubky ostrosti v závislosti na struktuře objektu. Díky objektivům s vysokým rozlišením (vysoká NA) a nastavitelnou aperturní clonou umožňují moderní světelné mikroskopy flexibilní přizpůsobení optiky požadavkům konkrétního vzorku. V případě stereomikroskopů je často nutné učinit určitý kompromis ve prospěch vyšší hloubky ostrosti, jak to často vyžaduje dimenze “z” u trojrozměrných struktur.

Ještě větší hloubka ostrosti

Sofistikovaný optický přístup společnosti Leica Microsystems, který ruší korelaci mezi rozlišením a hloubkou ostrosti ve stereomikroskopech, je FusionOptics ™. Zde jedna ze světelných drah poskytuje jednomu oku pozorovatele obraz s vysokým rozlišením a nízkou hloubkou ostrosti. Druhá světelná dráha zase poskytuje druhému oku obraz stejného objektu s nízkým rozlišením a vysokou hloubkou ostrosti.

Lidský mozek kombinuje dva samostatné obrazy do jednoho optimálního celkového obrazu, který nabízí vysoké rozlišení i vysokou hloubku ostrosti.

Dalším příkladem ilustrujícím fenomenální schopnosti lidského mozku je stereomikroskop Greenough. Zde jsou roviny objektů levé a pravé světelné dráhy navzájem v mírném úhlu. Na celkovém obrázku se zdá, že celá šrafovaná oblast je velmi kvalitně zaostřena, i když tomu tak není u levého ani u pravého obrázku.

Obr. 2: Objektové roviny stereomikroskopu Greenough s rozsahem hloubky ostrosti

 

(Zdroj originálního textu: Leica Microsystems. Redakčně upraveno.)

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací