Jak se vytvářejí ostrá zobrazení

Autoři: Ruedi Rottermann; Peter Bauer, Dipl. Geol.; Leica Microsystems

 

Hloubka ostrosti v mikroskopii

V mikroskopii je hloubka ostrosti často považována za empirický parametr. V praxi je určena korelací mezi numerickou aperturou, rozlišením a zvětšením. Možnosti nastavení moderních mikroskopů vytvářejí pro dosažení nejlepšího možného vizuálního dojmu optimální rovnováhu mezi hloubkou ostrosti a rozlišením – tedy dvěma parametry, které jsou teoreticky nepřímo korelované.

 

Praktické hodnoty pro vizuální hloubku ostrosti

V normách DIN / ISO je hloubka ostrosti na straně objektu definována jako „axiální hloubka prostoru na obou stranách roviny objektu, ve které lze objektem pohybovat bez zjistitelné ztráty ostrosti obrazu, zatímco polohy obrazové roviny a objektivu jsou zachovány”.

Standard však neposkytuje žádná vodítka, jak měřit detekční práh pro zhoršení zaostření. Autorem první publikace na téma hloubky ostrosti na základě vizuální zkušenosti byl Max Berek, který publikoval výsledky svých rozsáhlých experimentů již v roce 1927. Berekův vzorec udává praktické hodnoty vizuální hloubky ostrosti, a proto se používá dodnes. Ve své zjednodušené podobě zní následovně:

TVIS = n [λ / (2 × NA²) + 340 µm / (NA × MTOT VIS)]

TVIS: Hloubka ostrosti na základě vizuální zkušenosti

n: Index lomu média, ve kterém je objekt umístěn. Pokud je objekt posunut, je do rovnice zadán index lomu média, které tvoří měnící se pracovní vzdálenost.

λ: Vlnová délka použitého světla, pro bílé světlo: λ = 0,55 µm

NA: Numerická apertura na boku objektu

MTOT VIS: Celkové vizuální zvětšení mikroskopu

 

Pokud je ve výše uvedené rovnici celkové vizuální zvětšení nahrazeno vztahem užitečného zvětšení (MTOT VIS = 500 až 1 000 x NA), je vidět, že při první aproximaci je hloubka pole nepřímo úměrná druhé mocnině numerické apertury.

Obr. 1: Hloubka pole jako funkce NA pro λ = 0,55 µm a n = 1

 

Zejména při malém zvětšení lze hloubku ostrosti významně zvýšit zastavením, tj. zmenšením numerické apertury. To se obvykle děje s aperturní clonou nebo clonou v konjugované rovině. Čím menší však numerická apertura je, ​​tím nižší je boční rozlišení.

 

Jde tedy o nalezení optimálního vyvážení rozlišení a hloubky ostrosti v závislosti na struktuře objektu. Díky objektivům s vysokým rozlišením (vysoká NA) a nastavitelnou aperturní clonou umožňují moderní světelné mikroskopy flexibilní přizpůsobení optiky požadavkům konkrétního vzorku. V případě stereomikroskopů je často nutné učinit určitý kompromis ve prospěch vyšší hloubky ostrosti, jak to často vyžaduje dimenze “z” u trojrozměrných struktur.

Ještě větší hloubka ostrosti

Sofistikovaný optický přístup společnosti Leica Microsystems, který ruší korelaci mezi rozlišením a hloubkou ostrosti ve stereomikroskopech, je FusionOptics ™. Zde jedna ze světelných drah poskytuje jednomu oku pozorovatele obraz s vysokým rozlišením a nízkou hloubkou ostrosti. Druhá světelná dráha zase poskytuje druhému oku obraz stejného objektu s nízkým rozlišením a vysokou hloubkou ostrosti.

Lidský mozek kombinuje dva samostatné obrazy do jednoho optimálního celkového obrazu, který nabízí vysoké rozlišení i vysokou hloubku ostrosti.

Dalším příkladem ilustrujícím fenomenální schopnosti lidského mozku je stereomikroskop Greenough. Zde jsou roviny objektů levé a pravé světelné dráhy navzájem v mírném úhlu. Na celkovém obrázku se zdá, že celá šrafovaná oblast je velmi kvalitně zaostřena, i když tomu tak není u levého ani u pravého obrázku.

Obr. 2: Objektové roviny stereomikroskopu Greenough s rozsahem hloubky ostrosti

 

(Zdroj originálního textu: Leica Microsystems. Redakčně upraveno.)

Speciální akce na vybrané produkty společnosti Ray Biotech

Speciální akce na vybrané produkty společnosti Ray Biotech

Pokud u nás zakoupíte tři ELISA kity od společnosti Ray Biotech a použijete v objednávce slevový kód, třetí kit budete mít zdarma!

více informací
kategorie: imunologie
Protilátka měsíce – CD20 (klon L26) – myší monoklonální protilátka

Protilátka měsíce – CD20 (klon L26) – myší monoklonální protilátka

Antigen CD20 je neglykosylovaný fosfoprotein, který je exprimován na normálních a maligních lidských B buňkách a předpokládá se, že působí jako receptor během aktivace a diferenciace B buněk. Spolu s CD79a je CD20 jedním z nejdůležitějších markerů pro identifikaci novotvarů z B-buněk. Např. je CD20 exprimován ve velké většině případů B-buněčné leukémie/lymfomu.

více informací
Úvod do dekalcifikace

Úvod do dekalcifikace

Dekalcifikace popisuje techniku ​​odstraňování minerálů z kosti nebo jiné kalcifikované tkáně, aby bylo možné připravit kvalitní parafínové řezy, které si zachovávají všechny základní mikroskopické prvky. Dekalcifikace se provádí po důkladném zafixování vzorku a před rutinním zpracováním do parafínu. V tomto článku je popsána základní struktura kosti a jsou uvedeny technické možnosti pro přípravu řezů. Je zde diskutován postup pro dekalcifikaci a úspěšné monitorování procesu, a jsou také uvedeny některé oblíbené možnosti ve výběru reagencií.

více informací