Jak provést předběžný pre-experiment před vlastním ELISA experimentem

kategorie: imunologie
vytvořeno: 14.10.2021

(Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

 

ELISA (Enzymová imunosorbentní analýza) je technika biologické analýzy založená na imunoreakci antigenu a protilátky a účinné katalytické reakci enzymu. Lze ji použít ke kvalitativní a kvantitativní analýze cílového proteinu ve vzorku, jako je sérum a plazma. 

Kompletní ELISA kit zpravidla obsahuje všechna činidla potřebná pro Vaše experimenty a návod k použití. Pokud metodu ELISA chcete pro daný analyt použít poprvé, je dobrou volbou provést předběžný pre-experiment. U vzorku, který má být testován, tak můžete získat předběžné informace do budoucna. Například zjistíte, zda je třeba vzorek ředit, či nikoli. 

Jak tedy pre-experiment provést? 

  1. Při přípravě vzorku se řiďte návodem k použití. Pokud postup přípravy není v návodu  uveden, kontaktujte výrobce nebo dodavatele. 
  2. Všechna použitá činidla by měla být připravena v souladu s požadavky specifikace. Pro pre-experiment jsou obvykle dostačující 2 proužky destičky (16 jamek) (obr. 1).

 

Obr. 1 – Ředění vzorku v rámci pre-experimentu. Std = standard; Smpl, sample = vzorek; fold dilution = ředění

Pokud uvedeme jako příklad soupravu CSB-E04505m Mouse Brain derived neurotrophic facor, BDNF ELISA Kit, hodnoty OD (optické denzity) standardu budou následující:

Standard  OD  pg/ml 
S7  2.0365  1000 
S6  1.4281  500 
S5  0.9769  250 
S4  0.5931  125 
S3  0.3641  62.5 
S2  0.2563  31.2 
S1  0.2279  15.6 
S0  0.1529 

 

Testovanými vzorky byla mozková tkáň K1 a M1 (náhodná čísla). Pro předběžný pre-experiment byly zvoleny různé stupně ředění. Odpovídající hodnoty OD jsou následující:

Číslo vzorku  násobek ředění  OD  koncentrace 
K1  původní roztok  1.2293  380.80641 
10  0.3141  418.84472 
100  0.1507 
1000  0.1325 
M1  původní roztok  1.0488  291.60631 
10  0.2661  303.33879 
100  0.1446 
1000 

 

  1. Pomocí softwarového nástroje, např.  Curve Expert 1.4, vykreslete standardní křivku hodnoty OD a hodnoty koncentrace standardní látky takto: 

Obr. 2 – Standardní křivka. Osa y: koncentrace, osa x: optická denzita (OD), racionální funkce, údaje o koeficientech

(Podrobnosti o postupu kreslení lze nalézt v angličtině na adrese: https://www.cusabio.com/m-225.html).

Koncentraci testovaného vzorku můžete získat dosazením hodnoty OD vzorku do vzorce. (U vzorků s násobkem ředění je třeba nezapomenout násobit násobkem ředění). 

 

  1. Vhodný násobek ředění vzorku se určí na základě předběžného pre-experimentu. Poté můžete provést formální experiment. 

V experimentu detekce mozkové tkáně pomocí kitu CSB-E04505m lze na základě výsledku pre-experimentu uvažovat původní neředěný roztok. 

Konkrétní experimentální postup by se měl vždy řídit příslušným návodem. Uspořádání na destičce pak může být následující: 

(Poznámka: kompetitivní metoda se mírně liší. Je nutné striktně dodržovat specifikace v návodu.)

(Zdroj originálního textu: CUSABIO. Redakčně upraveno.)

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací