ELISA (Enzymová imunosorbentní analýza) je technika biologické analýzy založená na imunoreakci antigenu a protilátky a účinné katalytické reakci enzymu. Lze ji použít ke kvalitativní a kvantitativní analýze cílového proteinu ve vzorku, jako je sérum a plazma.
Kompletní ELISA kit zpravidla obsahuje všechna činidla potřebná pro Vaše experimenty a návod k použití. Pokud metodu ELISA chcete pro daný analyt použít poprvé, je dobrou volbou provést předběžný pre-experiment. U vzorku, který má být testován, tak můžete získat předběžné informace do budoucna. Například zjistíte, zda je třeba vzorek ředit, či nikoli.
Jak tedy pre-experiment provést?
1. Při přípravě vzorku se řiďte návodem k použití. Pokud postup přípravy není v návodu uveden, kontaktujte výrobce nebo dodavatele.
2. Všechna použitá činidla by měla být připravena v souladu s požadavky specifikace. Pro pre-experiment jsou obvykle dostačující 2 proužky destičky (16 jamek) (obr. 1).
Obr. 1 – Ředění vzorku v rámci pre-experimentu. Std = standard; Smpl, sample = vzorek; fold dilution = ředění
Pokud uvedeme jako příklad soupravu CSB-E04505m Mouse Brain derived neurotrophic facor, BDNF ELISA Kit, hodnoty OD (optické denzity) standardu budou následující:
| Standard | OD | pg/ml |
| S7 | 2.0365 | 1000 |
| S6 | 1.4281 | 500 |
| S5 | 0.9769 | 250 |
| S4 | 0.5931 | 125 |
| S3 | 0.3641 | 62.5 |
| S2 | 0.2563 | 31.2 |
| S1 | 0.2279 | 15.6 |
| S0 | 0.1529 | 0 |
Testovanými vzorky byla mozková tkáň K1 a M1 (náhodná čísla). Pro předběžný pre-experiment byly zvoleny různé stupně ředění. Odpovídající hodnoty OD jsou následující:
| Číslo vzorku | násobek ředění | OD | koncentrace |
| K1 | původní roztok | 1.2293 | 380.80641 |
| 10 | 0.3141 | 418.84472 | |
| 100 | 0.1507 | ||
| 1000 | 0.1325 | ||
| M1 | původní roztok | 1.0488 | 291.60631 |
| 10 | 0.2661 | 303.33879 | |
| 100 | 0.1446 | ||
| 1000 |
3. Pomocí softwarového nástroje, např. Curve Expert 1.4, vykreslete standardní křivku hodnoty OD a hodnoty koncentrace standardní látky takto:
Obr. 2 – Standardní křivka. Osa y: koncentrace, osa x: optická denzita (OD), racionální funkce, údaje o koeficientech
(Podrobnosti o postupu kreslení lze nalézt v angličtině na adrese: https://www.cusabio.com/m-225.html).
Koncentraci testovaného vzorku můžete získat dosazením hodnoty OD vzorku do vzorce. (U vzorků s násobkem ředění je třeba nezapomenout násobit násobkem ředění).
4. Vhodný násobek ředění vzorku se určí na základě předběžného pre-experimentu. Poté můžete provést formální experiment.
V experimentu detekce mozkové tkáně pomocí kitu CSB-E04505m lze na základě výsledku pre-experimentu uvažovat původní neředěný roztok.
Konkrétní experimentální postup by se měl vždy řídit příslušným návodem. Uspořádání na destičce pak může být následující:
(Poznámka: kompetitivní metoda se mírně liší. Je nutné striktně dodržovat specifikace v návodu.)
(Převzato od společnosti CUSABIO, redakčně upraveno.)