Imunohistochemie: typický pracovní postup

kategorie: imunohistochemie
vytvořeno: 5.3.2021

(Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

Imunohistochemie (IHC) spojuje imunologické, biochemické a mikroskopické techniky k získání vizuálních informací o proteinech a dalších makromolekulách ve tkáních. Cílové makromolekuly jsou detekovány pomocí značených protilátek, které pronikají do tkání a specificky vážou proteiny a další požadované buněčné složky, např. organely.

Na rozdíl od jiných formátů imunoanalýzy, jako je např. Western blot a ELISA, které poskytují kvalitativní a kvantitativní informace o cílových molekulách, jež jsou odstraněny z jejich normálního biologického umístění, IHC nám umožňuje kvalitativně a kvantitativně analyzovat cílové molekuly in situ, tudíž poskytuje informace o těchto složkách v jejich normálním (nebo patologickém) histologickém kontextu. V rámci IHC existuje mnoho přístupů a variací, v závislosti na nastavení a experimentálním cíli. V tomto článku vás provedeme typickým pracovním postupem IHC.

 

Obrázek 1: Typické imunohistochemické workflow

1. Příprava tkáně

Správné zacházení s tkáněmi a jejich příprava jsou zásadní pro spolehlivý výsledek barvení. Obvykle se epitopy a morfologie tkáně konzervují v parafinových tkáňových bločcích fixovaných ve formaldehydu (formalin-fixed paraffin-embedded – FFPE).

Tkáně (např. biopsie) nebo studované orgány se nejprve fixují ve formaldehydu*, který chemicky zesíťuje proteiny v tkáni a zablokuje všechny buněčné procesy, proteiny a makromolekuly konformačně v jejich přesném umístění v daném okamžiku. Po fixaci jsou tkáně zality do bloků parafínového vosku a poté rozřezány na velmi tenké plátky o tloušťce přibližně 4 až 5 um pomocí mikrotomu.

Nařezané tkáně jsou přeneseny na skleněná podložní sklíčka, která jsou potažena tkáňovým lepidlem. Sklíčka se poté před dalším zpracováním suší. Pro dosažení nejlepších výsledků je vhodné použít čerstvě izolované biopsie nebo malé kousky tkáně a ihned po odběru je zafixovat, aby se zachovala tkáňová architektura a zabránilo se degradaci.

Je běžné, že během fixování tkání dojde k degradaci malého množství proteinů ve vzorku. Jedním z řešení, jak se tomu vyhnout a nabarvit takové proteiny pomocí IHC, je kryokonzervace vzorku bezprostředně po disekci tkáně nebo po mírné fixaci, obvykle v alkoholovém roztoku. Zmrazené vzorky se poté zalijí do bloků ve vodě rozpustné pryskyřice a krájení se provede v kryostatu.

*Formaldehyd není jediný fixační roztok používaným v IHC. V závislosti na typu vzorku a citlivosti cílových epitopů lze použít i jiné aldehydy, alkoholové roztoky nebo zmrazení v kryoprotektivním roztoku.

2. Vyhledání požadovaných epitopů

Křížové vazby vyvolané formaldehydem nebo dlouhodobá fixace obecně mohou maskovat určité epitopy a bránit vazbě protilátek v následujících krocích. Cílem vyhledávání epitopů je tyto epitopy odmaskovat nebo znovu odkrýt. To se obvykle provádí pomocí přípravného kroku rehydratace vzorku a úplným odstraněním veškerého parafínu tak, aby to nezasahovalo do barvení v následných krocích. Je možné využít celou řadu strategií.

Běžné je ošetření trávicími enzymy, teplem nebo detergenty, případně jejich kombinací. Nejoblíbenějším přístupem k vyhledávání epitopů v FFPE vzorcích je teplem indukované odmaskování epitopů (HIER) v pufru Tris-EDTA při pH 9. Pamatujte, že zatímco odstranění parafínu je před barvením nezbytné, dodatečné odmaskování epitopů není nutné pro všechny epitopy.

Pokud pro vaše cílové epitopy neexistují žádné zdokumentované pokyny pro vyhledávání epitopů, ať už v literatuře, nebo v pokynech dodavatelů protilátek, budete muset tento krok optimalizovat sami pomocí pokusů a omylů.

3. Blokování nespecifických vazeb

Vazebná místa na proteinech přítomných ve vzorku tkáně, na která není primárně cíleno, jsou před přidáním primární protilátky blokována. Toho se dosáhne inkubací v pufru obsahujícím sérum, sušené odtučněné mléko, hovězí sérový albumin nebo jiné blokující činidlo. Tento pufr občas obsahuje i malé množství jednoho nebo více šetrných detergentů, např. Tween-20 či SDS, které napomáhají smáčení.

Může být také nutné blokovat endogenní proteiny, které napodobují nebo interferují s proteiny používanými v následných detekčních systémech (např. biotin, avidin, křenová peroxidáza) tak, aby se snížilo pozadí a riziko falešně pozitivní detekce. To se obvykle provádí fyzickým nebo chemickým blokováním veškeré endogenní aktivity biotinu nebo enzymu.

4. Primární protilátka

Na podložní sklíčko se aplikuje primární protilátka specifická pro cílový epitop*. Primární protilátky pro IHC by měly být vysoce specifické a pronikat do cílové tkáně. Méně specifické protilátky se mohou vázat mimo cílové epitopy, což vede k nespecifickým signálům na pozadí, které mohou významně ovlivnit vaši schopnost interpretovat experimentální výsledky.

Je možné zde využít monoklonální nebo polyklonální protilátky, z nichž každá má své vlastní výhody a nevýhody. Stručně řečeno, polyklonální protilátky mohou vázat mnoho epitopů na stejném cílovém proteinu a v tom tkví jejich výhoda. Nicméně schopnost vázat více epitopů může vést ke snížené specificitě, a tedy nespecifické vazbě. Na druhou stranu monoklonální protilátky vážou pouze jeden epitop a jsou často specifičtější, nemusí však být ideální pro cíle s malým výskytem ve tkáni.

Bez ohledu na to, jaký typ protilátky je použit, je nutné optimalizovat koncentraci protilátek pro každou novou analýzu (tj. vždy, když se použije nový typ vzorku/tkáně). Pečlivá optimalizace tohoto kroku je u IHC kritická, protože úspěch primární protilátky nezávisí jen na její specificitě a afinitě k cíli, ale také na hojnosti a dostupnosti specifických a nespecifických epitopů ve vzorku.

Použití příliš velkého množství protilátky může zvýšit pozadí, pokud jsou cílové epitopy nasyceny navázanou protilátkou. Použití menšího množství primární protilátky může tento problém zmírnit. Možným kompromisem je pak zobrazení signálu s nižší intenzitou, v případě protilátky s nízkou afinitou však může dojít k falešně negativnímu výsledku. Nenavázaná primární protilátka se odstraní opláchnutím sklíček ve vhodném promývacím roztoku, který obvykle obsahuje stopové množství detergentu a solí.

* Kromě protilátek mohou být použity i jiné vazebné molekuly, jako jsou fragmenty protilátek, peptidy nebo jiné malé molekuly.

5. Detekce

Během detekce je lokalizována a vizualizována interakce primární protilátky s cílem jako měřitelný signál. Ačkoli existují i ​​jiné metody, nejčastěji se používají detekční metody založené na protilátkách. Ty lze rozdělit do dvou kategorií: přímé a nepřímé, v závislosti na tom, zda je primární (přímá) nebo sekundární protilátka (nepřímá) konjugovaná s enzymovou nebo fluorescenční značkou. Výběr správné metody detekce vyžaduje úvahy o očekávané úrovni exprese cíle, jeho dostupnosti a typu požadovaného odečtu, a o dostupném vybavení, tj. chromogenním signálu (světelná mikroskopie) nebo fluorescenčním signálu (fluorescenční mikroskopie).

V přímé detekci je primární protilátka značena enzymem nebo fluoroforem a signál generovaný po přidání substrátu nebo excitaci fluoroforu se tak stává výsledkem analýzy.

Metody nepřímé detekce často využívají ke zvýšení citlivosti detekce interakci mezi biotinem a jeho vazebnými partnery, např. (strept)avidinem. V takovém případě se po odmytí nenavázané primární protilátky aplikuje biotinylovaná sekundární protilátka a její přítomnost je lokalizována v cílovém místě po aplikaci komplexu avidin-enzym (např. křenová peroxidáza nebo alkalická fosfatáza), kde enzym za přítomnosti vhodného substrátu produkuje nerozpustnou barevnou sraženinu. Protože každá molekula biotinu může vázat více molekul avidinu, detekční signál je zesílen. Je-li požadována detekce fluorescence, použije se ke generování fluorescenčního signálu fluorescenčně značený avidin nebo enzym.

Jak již bylo zmíněno dříve, endogenní biotin může vést k problémům s pozadím v IHC barvení. Chcete-li se těmto problémům vyhnout, můžete se místo nastavení biotin-avidin rozhodnout pro detekční metodu založenou na polymeru. Zde je sekundární protilátka namísto jediného enzymu přímo spojena s polymerem enzymů. Protože každá sekundární protilátka je spojena s mnoha enzymy, signál z každé primární interakce protilátka-antigen je značně zesílen, čímž se zvyšuje citlivost testu.

6. Kontrastní barvení

Jakmile je barvení dokončeno, tedy jakmile je po detekci, je často výhodné zahrnout do barviva kontrastní látku, která zvýší kontrast mezi obarvenými a nezbarvenými oblastmi v tkáňové části, což usnadňuje určení zajímavých histologických znaků. Existuje celá řada barviv, některé z nich jsou specifické pro buněčné struktury. Hematoxylin se nejčastěji používá pro vzorky FFPE v případě, že se využívají detekční metody založené na světelné mikroskopii. Tímto barvivem se obarví bleděmodře cytoplazma a tmavě modře jádra buněk. Když se používá fluorescenční detekce, fluorescenční barviva, která selektivně váží nukleové kyseliny, se obvykle používají jako kontrastní barvy pro označení buněčných jader.

Po kontrastním vybarvení se na obarvená sklíčka nanesou krycí sklíčka, která se poté utěsní, obvykle čirým lakem na nehty nebo vhodnou komerčně dostupnou pryskyřicí. Tento krok je důležitý, aby se zabránilo solubilizaci enzymatických produktů generovaných během detekce a aby se zabránilo fotobělení jakýmikoli zbývajícími fluorofory. Uzavřené diapozitivy jsou pak vhodné pro analýzu obrazu a dlouhodobé skladování.

7. Analýza obrazu

V závislosti na použitém formátu detekce jsou sklíčka vizualizována světelnou nebo fluorescenční mikroskopií. Je možno také zvolit konfokální mikroskopii pro větší detail a lepší zobrazovací schopnosti. Kromě toho lze vzorky procházet pomocí rychlých analýz obrazu (high content screening) pro rychlou kvantifikaci a porovnání dat z více vzorků. A se správným vybavením je také možné sklíčka naskenovat a získat tak vysoce kvalitní obrázky v digitálním formátu pro další analýzu a pro použití v publikacích a prezentacích.

 

(Převzato ze zahraničního zdroje, redakčně upraveno.)

Incucyte® – Využijte analýzu živých buněk uvnitř vašeho inkubátoru

Incucyte® – Využijte analýzu živých buněk uvnitř vašeho inkubátoru

Seznamte se s platformou Incucyte společnosti Sartorius a zjistěte, ve které variantě by byl nejvhodnější pro Vaši laboratoř!

více informací
Workshop a prezentace přístrojů Sartorius – Praha a Hradec Králové

Workshop a prezentace přístrojů Sartorius – Praha a Hradec Králové

Srdečně Vás zveme na workshop a prezentaci Sartorius Octet N1 v pondělí 7.11.2022 v Hradci Králové a workshop a prezentaci Incucyte a Octet ve středu 9.11.2022 v Praze.

více informací
Představujeme Corning® Lambda™ EliteMax, poloautomatický stolní pipetor

Představujeme Corning® Lambda™ EliteMax, poloautomatický stolní pipetor

Stolní pipetor Corning Lambda EliteMax Benchtop Pipettor je poloautomatický, cenově dostupný a snadno použitelný manipulátor kapalin pro laboratorní stoly, které jsou omezené na prostor, ale vyžadují výkon a schopnost provádět vysokokapacitní screeningy pro velké objemy testů. Více se dočtete v následujícím textu.

více informací