Fluorescenční mikroskopie

Autor: Wymke Ockenga

Philipps University Marburg, Institute of Cytobiology and Cytopathology, Německo

Úvod

Fluorescenční mikroskopie je speciální formou světelné mikroskopie. Využívá schopnost fluorochromů emitovat světlo po excitaci světlem určité vlnové délky. Požadované proteiny mohou být značeny fluorochromy pomocí konjugovaných protilátek nebo přímým značením fluorescenčními proteiny (např. GFP). Toto umožňuje stanovit distribuce jediného druhu molekuly, jeho množství a jeho lokalizace uvnitř buňky. Kromě toho mohou být prováděny studie o kolokalizaci a interakcích, koncentraci iontů pozorovaných pomocí reverzibilně vázajících barviv, například Ca2+ a fura-2 (kyselina aminopolykarboxylová), a o buněčných procesech, jako je endocytóza a exocytóza. Pomocí fluorescenční mikroskopie je také možné zobrazovat částice v superrozlišení.

 

Stokesův posun

Důležitým rysem fluorescence je Stokesův posun. Ten popisuje rozdíly v energetické hladině excitovaného a emitovaného fotonu. Foton emitovaný fluorochromem má větší vlnovou délku než foton, který byl excitován. To je způsobeno uvolňováním energie do okolí po excitaci fluorochromu, ale před samotným emitováním fotonu. Výsledný posun vlnové délky umožňuje rozeznat excitované světlo od emitovaného světla. Absorpci a emisi energie lze považovat za specifické vlastnosti molekul.

 

Fluorescenční mikroskop

Fluorescenční mikroskop (vzpřímený nebo inverzní) je podobný běžnému světelnému mikroskopu s tou výjimkou, že osvětlení monochromatickým světlem zajišťuje laser nebo jasný a silný světelný zdroj, jako je rtuťová výbojka nebo xenonová oblouková lampa. Kromě toho fluorescenční mikroskop obsahuje excitační a emisní filtry. Excitační filtr propouští pouze světlo, které je schopné excitovat vzorek, resp. jeho specifické barvivo. Světlo emitované vzorkem musí nejprve projít emisním filtrem, než dosáhne detektoru. Emisní filtr je průchodný jen pro světlo s určitou vlnovou délkou, jako je světlo vyzařované vzorkem.

Obr. 1: Dráha světla procházejícího fluorescenčním mikroskopem

 

V posledních letech se jako zdroj světla pro fluorescenční mikroskopy využívají také LED (Light-Emitting Diode – elektroluminiscenční dioda) diody. Vlnová délka světla vyzařovaného LED diodami závisí na materiálu použitém pro výrobu. Ve většině případů je však stále nutný excitační filtr, protože LED diody často vyzařují světlo v poměrně širokém rozsahu vlnových délek.

Většina fluorescenčních mikroskopů jsou epifluorescenční mikroskopy. Osvětlovací zdroj a čočka objektivu jsou umístěny na stejné straně vzorku, a světlo tak vzorkem neprochází. Kromě excitačního a emisního filtru je pro tento druh fluorescenčního mikroskopu zapotřebí dichroické zrcadlo. Dichroické zrcadlo umožňuje průchod světla určité vlnové délky skrz, zatímco světlo jiných vlnových délek se odráží. Filtry a dichroické zrcadlo jsou často zapojeny společně do filtrační kostky.

Obr. 2: Princip filtrační kostky

 

Excitační světlo prochází excitačním filtrem a je směrováno do dichroického zrcadla. Dichroické zrcadlo pak odráží světlo skrz objektiv směrem ke vzorku. Fluorochromy ve vzorku jsou excitovány a emitují fotony. Toto emisní světlo prochází objektivem zpět do dichroického zrcadla. Vyzařované světlo má vhodnou vlnovou délku a je schopné projít skrz. Excitační světlo, které je odraženo vzorkem, není schopno dichroickým zrcadlem projít a bude blokováno. Pokud excitační světlo je schopné projít dichroickým zrcadlem, bude blokováno, jakmile dosáhne emisního filtru. Světlo procházející emisním filtrem již lze měřit detektorem.

Ve fluorescenční mikroskopii se používají různé typy filtrů. Lze rozlišit pásmový, dlouhý a krátký filtr. Pásmové filtry propouštějí pásmo vlnových délek, zatímco světlo s větší nebo menší vlnovou délkou bude blokováno. Filtry s dlouhým a krátkým průchodem jsou okrajové filtry. Filtry s dlouhým průchodem propouštějí světlo dlouhých vlnových délek. Světlo s vlnovou délkou nad určitou mezní hodnotou nebude moci projít. Naproti tomu filtry s krátkým průchodem přenášejí krátké vlnové délky a blokují dlouhé.

Obr. 3: Transgenní myší embryo, GFP

Obr. 4: Fluorescenční in situ hybridizace chromozomů. Červená: TRITC, modrá: CY5, zelená: FITC

 

Různé techniky ve fluorescenční mikroskopii

Fluorescenční mikroskopie je široce používána a nabízí velkou specifitu. Široké spektrum technik umožňují řešit různé problémy, a dokonce i obejít difrakční limit, který popsal Ernst Abbe.

Lokalizace různých druhů molekul může být stanovena společným barvením organel, například cytoskeletu nebo membrán. Konfokální laserová skenovací mikroskopie (CLSM – Confocal Laser Scanning Microscopy) umožňuje pozorovat oblasti ve vzorku bez signálů z vnější oblasti ohniskové roviny a dovoluje optické dělení. Fluorescence s totálním vnitřním odrazem (TIRF – Total Internal Reflection Fluorescence) je technika, která umožňuje pozorování tenké oblasti v blízkosti buněčného povrchu. Evanescentní vlna excituje fluorochromy v této oblasti.

Technika pro pozorování dynamiky molekul je obnovení fluorescence po fotovybělení (FRAP – Fluorescence Recovery After Photobleaching). Fluorochromy v omezené oblasti jsou fotovybělené a lze měřit difúzi nevybělených molekul do této oblasti. Interakční studie lze provádět pomoci mikroskopie s fluorescenčním přenosem energie (FRET). Excitovaný donorový chromofor může přenášet energii na akceptorový fluorochrom a excitovat jej. To je možné jenom tehdy, když jsou si navzájem velmi blízko. Pokud jsou tato barviva spojená s různými proteiny, budou schopná přenášet energii a fluoreskovat pouze pokud budou proteiny vzájemně interagovat.

Techniky, které umožňují snímkování v superrozlišení, jsou vyčerpání stimulovanou emisí (STED – stimulated emission depletion), GSD (ground-state depletion), GSDIM (ground state depletion microscopy followed by individual molecule return), PALM (photoactivated localization microscopy) a STORM (stochastic optical reconstruction microscopy). Superrozlišovací mikroskopy používané pro tyto techniky se také nazývají nanoskopy, protože rozlišují obrazy v měřítku nanometrů.

Obr. 5: Purkyňova buňka, trojitě značená parasagitální část mozkové kůry myši. Červená: anti-calbindin-D28k/Cy3, zelená: anti-GFAP/Cy5, modrá: Hoechst 33258

Obr. 6: Myší tkáňový řez, autofluorescence, FLIM mikroskopie (fluorescence lifetime imaging)

 

(Převzato ze zahraničního zdroje, redakčně upraveno.)

 

psali jsme na blogu „Co je to fotomanipulace?“ – odkaz

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací