ELISA
Multiplex array
Western blot a RIA
která metoda je „ta pravá“?

1. Western blot

Western blot neboli imunoblot je základní biochemická metoda, která se využívá k detekci přítomnosti specifického proteinu ve vzorku. Směs proteinů se nejprve rozdělí na základě velikosti a/nebo náboje pomocí gelové elektroforézy. Takto rozdělené proteiny se následně přenesou z gelu na membránu a na membráně se specifický protein zviditelní reakcí s protilátkou.

Touto metodou je možné porovnat množství proteinu v různých vzorcích. Výhodou Western blotu je jeho vysoká specifita, protože falešně pozitivní výsledky způsobené nespecifickým navázáním protilátek můžeme vyloučit na základě znalosti molekulové hmotnosti hledaného proteinu.

Na stranu druhou může metoda poskytnout falešně negativní výsledek vlivem velkých proteinů, které mohou obtížně procházet gelem při elektroforéze. Významným omezením použití Western blotu je fakt, že se proteiny denaturují. Metoda má i další nevýhody – je časově náročná. Oproti dalším metodám spotřebuje velké množství vzorku a automatizace je složitější než v případě dalších metod.

2. ELISA

ELISA (zkratka z anglického enzyme-linked immunosorbent assay) je metoda pro stanovení jednoho proteinu, která využívá specifické vazby proteinu (antigenu) a protilátky. Protilátka je značená kovalentně navázaným enzymem. Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu přidaného substrátu na barevný (nebo fluorescenční) produkt, který se následně stanovuje spektrofotometricky (nebo fluorimetricky).

ELISA je obvykle prováděna na mikrotitračních destičkách s 96 – 384 jamkami. Díky tomu má ELISA vyšší kapacitu než Western blot a dá se snadno automatizovat. Narozdíl od Western blotu může být použita pro stanovení proteinu s nativní strukturou. Metoda má řadu variant, které se hodí k různým záměrům, každá má své výhody i omezení.

Přímá ELISA je obvykle využívána ke stanovení imunitní odpovědi na antigen. U této metody dochází k reakci antigenu imobilizovaného na pevný povrch s protilátkou značenou enzymem. Metoda je velmi rychlá a není náchylná k chybám. Nevýhodou je, že proteiny ve vzorku se navážou na povrch jamky destičky a výsledek vykazuje šum na pozadí. Kvůli absenci sekundární protilátky nedochází ke zvýšení signálu, což snižuje citlivost metody.

Nepřímá ELISA se používá ke stanovení celkové koncentrace antigenu ve vzorku. Uspořádání je vyobrazeno na obr.: 3. Antigen je imobilizován na pevný povrch, stejně jako v případě přímé ELISA. Detekce zde představuje proces dvou krokový. V prvním kroku dochází k vazbě neznačené primární protilátky na antigen. V druhém kroku je aplikována enzymaticky značená sekundární protilátka. Toto uspořádání je ekonomické, protože značená protilátka je univerzální. Metoda má také vyšší citlivost, protože na molekulu primární protilátky se může vázat více molekul sekundární protilátky, čímž se násobí snímaný signál. Nevýhodou je delší čas provedení kvůli inkubaci s druhou protilátkou.

Sendvičová ELISA používá dvojici protilátek (zachytávající a detekční), z nichž každá reaguje s jinou oblastí antigenu. V tomto uspořádání je možné analyzovat komplexní vzorek, protože protilátka navázaná na dně destičky zachytí jen požadovaný protein. Tím se řeší nevýhoda přímé a nepřímé metody, kde se vzorek váže na dno destičky. Metoda je také velmi specifická. Dvojice protilátek však musí být navržena tak, aby nedocházelo k jejich vzájemné interakci a v důsledku toho k falešně pozitivní chybě. Sendvičová ELISA může být přímá i nepřímá.

Kompetitivní ELISA se využívá v případě, kdy je k dispozici jen jeden typ protilátky k antigenu. Jakékoli z prvních tří uspořádání může být adaptováno na kompetitivní. Uvedeme jeden příklad – adaptace nepřímého uspořádání metody ELISA na uspořádání kompetitivní. Na povrch jamky destičky je navázané známé množství studovaného proteinu. Tento vázaný protein pak “soutěží” o přidané protilátky s proteinem v analyzovaném vzorku. Po ustanovení rovnováhy se analyzovaný vzorek z destičky vymyje a prostřednictvím sekundární protilátky se stanovuje signál protilátek zachycených na destičce. Čím vyšší je signál, tím menší je koncentrace proteinu ve vzorku. Výhodou metody je, že se může použít pro analýzu komplexního vzorku. Je náročnější na čas přípravy destičky, na kterou je potřeba nanést známé množství antigenu.

3. Radioimunoanalýza (RIA)

Radioimunoanalýza je charakteristická použitím molekul značených radioaktivními isotopy. Často používanou značkou je isotop jódu ¹²⁵I (který vykazuje gamma radioaktivitu) vázaný v molekule tyrosinu. Signál je detekovaný pomocí scintilačního detektoru.

Samotné provedení je podobné kompetitivní ELISE (známé množství antigenu je radioaktivně označeno) nebo sendvičové ELISE (radioaktivně značená je sekundární protilátka). Citlivost této metody je vysoká, protože k detekci gama záření stačí velmi malé množství vzorku. Specifita RIA je obdobná jako u ELISY. Výhodou je přímá detekce radioaktivní značky oproti ELISE, kde musí nejprve proběhnout enzymově katalyzovaná reakce. Nevýhodou je drahé snímací zařízení a omezení vyplývající z práce s radioaktivním materiálem. Proto je tato metoda pro menší laboratoře obtížně dosažitelná.

4. Multiplex array

Multiplex array (proteinový čip) je metoda, která dokáže analyzovat více proteinů ve vzorku současně. Je podobná sendvičové ELISE – na destičku/membránu jsou na přesná místa „natištěny“ požadované protilátky. Na tyto protilátky se navážou proteiny ze vzorku. Na proteiny se následně navážou detekční protilátky, které mohou být vizualizovány.

Pro multiplex array jsou používány detekční systémy jak chemiluminiscenční (využívající enzymaticky značené sekundární protilátky), tak fluorescenční (využívající vazby biotinem značené sekundární protilátky a avidinu konjugovaného s fluorochromem). Vyhodnocení probíhá pomocí skenerů a speciálního softwaru, který vyhodnotí sílu fluorescenčního/chemiluminiscenčního signálu jako koncentraci proteinu ve vzorku.

Na rozdíl od sendvičové ELISY je kvůli přítomnosti velkého množství proteinů i protilátek nutné použít vysoce specifické protilátky, aby se předešlo falešně pozitivním výsledkům.

Výhodou multiplex array je současná analýza více proteinů z jednoho vzorku. Díky tomu se výrazně zkrátí čas potřebný na provedení analýzy, je potřeba menší množství vzorku i dalších reagencií. Současně miltiplex array nabízí ucelenější analýzu vzorku, ať už pro výzkumné účely, diferenciální diagnózy nebo monitorování terapeutických intervencí. Destičky mohou být připraveny přímo na míru a proces vyhodnocení je možné automatizovat.

Nevýhodou metody je vyšší cena jak samotných čipů, tak i souvisejícího vybavení (vyhodnocení atd.), proto je multiplex array vhodná zejména tam, kde se velmi často opakuje analýza podobných vzorků – např. rutinní diagnóza civilizačních chorob. Finančně přístupnější pro menší laboratoře je možnost nechat analyzovat vzorky centralizovaně. Uplatnění najde metoda i v případě, kdy máme velmi omezené množství proteinu nebo protilátek.

Jestliže vás zajímá tato metoda, podívejte se na naši službu Multiplexové stanovení cytokinů a jiných faktorů na tomto odkazu.