Celá pravda o Real-Time PCR – 2. část

Vítejte ve druhé části naší série o real-time PCR. V první části jsme prošli základy real-time PCR, jeho výhody oproti end-point PCR, typické pracovní postupy, výstupy dat a výběr dostupných fluorescenčních systémů značení.

V navazujícím článku se podíváme na různé dostupné kvantifikační metody, tipy pro nastavení, design primeru a kontrolu kvality.

Metody kvantifikace – Která z nich je pro vás ta pravá?

Během fáze plánování experimentu se budete muset rozhodnout, která z dostupných kvantifikačních metod je pro váš výzkum ta nejvhodnější. Podívejme se na dostupné metody a vstupy a výstupy každé z nich.

1. Absolutní kvantifikace (abs. kvant.)

Absolutní kvantifikace vám umožňuje zjistit absolutní počet kopií vaší cílové sekvence ve vzorku porovnáním amplifikačních křivek generovaných z vašich vzorků se standardní křivkou generovanou se známými koncentracemi vaší cílové sekvence.

Populární aplikace absolutní kvantifikace jsou stanovení počtu virových kopií při darování krve nebo ochrana veřejného zdraví, např. kolik mikroorganismů je v pitné/užitkové vodě.

Generování křivek standardů pro absolutní kvantifikaci

Připravte si desetinásobné sériové ředění standardu, který obsahuje vaši cílovou sekvenci ve známé koncentraci.
Standardní real-time PCR křivka je generována jako semi-logaritmická regresní linie s hodnotou Ct (osa Y) vs. logaritmus templátové DNA (osa X).
Sklon křivky vám poskytne představu o účinnosti PCR. Za optimálních podmínek by se počet amplikonů teoreticky měl během každého cyklu zdvojnásobit a účinnost PCR by byla 2. Dokonalá účinnost PCR je indikována sklonem -3,22. Moderní přístroje mohou snadno vypočítat účinnost PCR na základě standardní křivky.

Účinnost PCR

Protože každý faktor, který ovlivňuje PCR reakci, by musel fungovat pro 100% účinnost zcela optimálně, většina PCR reakcí má účinnost menší než 2.
Pokud je vaše standardní křivka lineární, neměla by být účinnost PCR lehce nižší než 2 pro abs. kvant. velký problém, pokud zároveň standardní křivky nezávisle generované za stejných podmínek přinášejí podobné výsledky.

Doporučení pro výběr standardu

Standardní křivky mohou být velmi snadno reprodukovatelné, ale budou vždy jen tak dobré jako váš standard! Spolehlivá abs. kvant. předpokládá, že znáte absolutní množství vašeho standardu. Běžnými zdroji standardů jsou plazmidová DNA, oligonukleotidy, purifikované PCR amplikony a další. Při použití těchto zdrojů se koncentrace DNA měří pomocí A260 a převádí se na počet kopií pomocí molekulové hmotnosti cílové sekvence DNA.
Jednotka měření vašeho neznámého vzorku je definována vaším standardem, například kopie/ng celkové DNA, kopie/buňka, kopie/ml krve.
Budete si muset předem zjistit, jak stabilní je váš standard během skladování. Přinejmenším byste si měli připravit alikvoty, abyste se vyhnuli několika cyklům zmrazení a rozmrazení stejné šarže materiálu. Vyberte si takový standard, který je možné pravidelně připravovat podle potřeby.
Abs. kvant. předpokládá identickou účinnost amplifikace pro nativní cíl (například v přípravě gDNA) a standard použitý ke generování standardní křivky. Zvažte, jak dobře váš standard skutečně reprezentuje váš neznámý vzorek. Je například pravděpodobné, že váš neznámý vzorek bude obsahovat inhibitory PCR? Pokud ano, přijměte vhodná opatření ke snížení tohoto rizika. Dále platí, že pokud se snažíte kvantifikovat transkribovanou mRNA pomocí abs. kvant., může být nejrelavantnější použít jako standard in vitro transkribovanou RNA.

2. Relativní kvantifikace (rel. kvant.)

Tato metoda měří relativní rozdíly v úrovních exprese mRNA mezi dvěma nebo více vzorky. Primárně se používá pro analýzu genové exprese, kde se úrovně exprese cílových genů srovnávají s housekeeping (provozními) geny. Jednotky použité k vyjádření relativních veličin jsou irelevantní a relativní veličiny lze porovnávat napříč několika experimenty.

Housekeeping geny

Obecně jsou definovány jako konstitutivně exprimované geny, které jsou vyžadovány pro normální buněčnou funkci, a jež jsou exprimovány ve všech buňkách organismu.

Typické housekeeping geny zahrnují: aktin, tubulin, GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu), translační elongační faktory a ribozomální RNA. Každá oblast výzkumu má své vlastní běžně používané housekeeping geny, takže se doporučuje konzultovat s literaturou.

Přestože se mnoho vědců spoléhá na jeden konkrétní housekeeping gen, velmi se doporučuje zahrnout rovnou několik těchto genů do všech rel. kvant. experimentů, protože si nikdy nemůžete být jisti, že exprese vašeho preferovaného provozního genu není ovlivněna nastavením podmínek vašeho experimentu.

Modely pro relativní kvantifikaci

Standardní křivky se obvykle používají v rel. kvant. k výpočtu účinnosti PCR housekeeping a cílových genů. Je však také možné provést rel. kvant. bez standardních křivek, a pro srovnávací analýzu genové exprese jsou k dispozici také různé matematické modely podle toho, zda znáte přesnou účinnost PCR nebo ne. Srovnávací metoda Ct se často používá k porovnání hodnoty Ct jednoho cílového genu s druhým v jednom vzorku pomocí vzorce: 2ΔΔCT (1). I když pro jejich použití není nutné vědět, jak jsou tyto modely odvozeny, můžete si o nich přečíst více ve zdrojích uvedených na konci článku.

Design primeru

Vynikající design primerů je základním předpokladem pro real-time PCR bez ohledu na to, jak provádíte kvantifikaci. Existuje několik dobrých zdarma přístupných online zdrojů, které vám pomohou začít, například Primer 3 a NCBI Primer Design Tools (2,3).

Ačkoli se názory na kritéria pro design primerů PCR liší, zde je několik obecných ukazatelů, na kterých se většina uživatelů shoduje:

Pokud je to možné, zkuste překlenout intronovou oblast – to zajistí specificitu vůči cDNA v případě, že váš vzorek obsahuje kontaminující gDNA
Snažte se dosáhnout teploty tání přibližně 60 °C
Navrhněte primery tak, aby délka vašeho amplikonu byla mezi 80-200 bp
Dávejte pozor na sekundární struktury / dimery primerů, protože tyto výrazně ovlivní účinnost PCR
Pro představu o možných amplifikacích mimo cíl se doporučuje zkontrolovat vaši finální sekvenci primerů proti zkoumanému organismu pomocí NCBI Primer-BLAST
Podrobnější tipy týkající se designu primerů vám doporučujeme konzultovat s pokyny dodavatele reagencií pro real-time PCR

Nastavení real-time PCR

Pro přesnou kvantifikaci vyžaduje real-time PCR více kontrol než tradiční PCR
Vždy přidejte 3 jamky na negativní kontroly pro každý pár primerů, včetně primerů pro housekeeping geny
Při analýze mRNA vždy přidejte kontrolu bez reverzní transkriptázy (RT) (ve 3 jamkách)
Pokud chcete zohlednit potenciální chyby při pipetování, otestujte všechny reakce housekeeping a cílových genů v trojím provedení
Naplánujte si pečlivě rozvržení destičky a snažte se navrhnout takové rozložení, které můžete použít opakovaně
Rozlište jamky na destičce na základě:
- 1. Přítomnosti nebo nepřítomnosti templátu
- 2. Housekeeping nebo cílových genů
- 3. Kontrolních podmínek nebo experimentálních podmínek
Pečlivě naprogramujte podmínky cyklů a důkladně ověřte jejich nastavení!

Křivky tání ukončeného cyklu

V části 1 jsme zmínili, že je možné posoudit mimo-cílovou amplifikaci a tvorbu dimeru primeru pomocí následných kontrol kvality. Odkazovali jsme se přitom na post-runové křivky tání. Tyto kontroly můžete do jisté míry provádět spuštěním cyklu svých real-time PCR produktů na agarózových gelech, ale je to proces náročný jak časově, tak na činidla, a nedovolí vám rozlišovat mezi cílovými a mimo-cílovými amplikony podobných velikostí.

Křivky tání (nebo disociace) po ukončení cyklu jsou považovány za zásadní pokud používáte SYBR Green, protože SYBR Green váže dsDNA nespecificky, nezávisle na sekvenci.

Do běhu real-time PCR můžete začlenit křivku tání po ukončení cyklu následujícím způsobem:

Poznámka: pokyny pro křivku tání přidejte do vašeho PCR programu.

Ihned po posledním kole amplifikace PCR se reakce podrobí teplotnímu gradientu 50 – 95°C a kontinuálně se sleduje fluorescence. dsDNA je během tohoto kroku denaturována
Bod / teplota, při které se dsDNA „roztaví“ na ssDNA, je pozorován jako pokles fluorescence při disociaci barviva
Software vašeho přístroje převede křivky tavení na jasné píky tání, kde jsou produkty různých délek / vlastností zobrazeny jako zřetelné píky
Křivky tání se také používají při genotypizaci, protože alely, které se liší jedním nebo několika nukleotidy, budou mít mírně odlišné teploty tání, které jsou viditelné jako různé píky tání. Tímto způsobem lze odlišit homozygoty, kteří se jeví jako jeden pík, od heterozygotů, kteří se jeví jako dva píky.

Na konci každého běhu je čas na kontrolu kvality!

Doporučuje se vytvořit si návyk na hodnocení kvality každého běhu real-time PCR. Pomůže vám mít k dispozici soubor otázek. Například:

Získali jste skutečně amplifikační křivky v každé jamce, která obsahovala templát?
Jsou vaše replikáty blízko u sebe? Zpravidla by se replikáty neměly lišit o více než 0,1-0,2 Cts
Jsou vaše negativní kontroly opravdu negativní?
Pokud se díváte na mRNA, jsou vaše kontroly bez reverzní transkriptázy (RT) negativní?
Jak vypadá vaše křivka tání?
Dávají vaše data smysl?

Několik tipů na závěr

Zde je několik užitečných tipů, které mohou pomoci zvýšit celkovou úspěšnost vašich real-time PCR experimentů:

Mějte vyhrazený pracovní prostor pro zpracovávání real-time PCR reakcí. Ideálně potřebujete místo, které je čisté, uklizené a bez kontaminace nukleázami a nukleovými kyselinami. Můžete zvážit práci v laminárním boxu.
Vždy používejte speciální sadu přesně kalibrovaných pipet a vysoce kvalitní filtrové špičky bez DNas / RNas.
Po syntéze cDNA proveďte test pomocí end-point PCR, abyste se ujistili, že reakce obsahuje materiál, který stojí za amplifikaci pomocí real-time PCR, a přidejte gDNA jako kontrolu.
Pokud získáte hodnoty Ct, které jsou velmi nízké / blízko prahové hodnoty, nařeďte použitou cDNA / DNA.
Reagencie dobře promíchejte pipetováním při nastavování PCR a krátce před každým spuštěním promíchejte obsah destičky.
Alikvotujte své templáty a primery, abyste zabránili opakovanému zmrazení a rozmrazení.
Uchovávejte primery ve vhodném pufrovaném roztoku pro dlouhodobé skladování.
Proveďte nová ředění svých nukleových kyselin pro každou standardní křivku.
Pokud máte pochybnosti o některém ze svých vzorků, proveďte výběr produktů PCR na agarózových gelech.
Pokud stále máte pochybnosti, vyhledejte jiného odborníka!

Těmito dvěma články jsme se pokusili pokrýt velmi rozsáhlé téma a poskytnout vám základní přehled různých dostupných možností detekce a kvantifikace, a také tipy, které vám mohou pomoci na cestě k ohromujícím výsledkům real-time PCR.

Pokud se chcete dozvědět více, doporučujeme vám zkontrolovat užitečné zdroje uvedené níže.

(Převzato od společnosti Nordic BioSite, redakčně upraveno.)

Reference:

Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Methods. 25(4):402-8.
Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T, Ye J, Faircloth BC, Remm M, Rozen SG (2012) Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40(15):e115.
Koressaar T, Remm M (2007) Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics 23(10):1289-91.

Prémiové produkty pro vědu, zdravotnictví a výrobu