7 tipů pro optimální DNA transfekci

vytvořeno: 8.3.2021

(Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

 

Transfekce DNA je hlavním nástrojem pro současné genetické, buněčné i molekulárně biologické studie. Pochopení základních mechanismů a různých parametrů ovlivňujících transfekci je zásadní pro optimální, reprodukovatelné a důvěryhodné výsledky. Dodržování těchto sedmi tipů vám navíc zajistí, že budou vaše výsledky spolehlivé.

 

Přizpůsobte podmínky transfekce vašemu experimentu.

Transfekční podmínky by měly být optimalizovány podle typu buněk, velikosti plazmidu, počtu plazmidů, typu exprese požadovaného genu, kultivační nádoby a transfekčního činidla. Znovu optimalizujte podmínky pro každou novou buněčnou linii.

 

Transfektujte zdravé buňky.

Buňky po rozmrazení pasážujte alespoň dvakrát, aby jim bylo umožněno zotavit se před transfekcí a použijte buňky s nízkým počtem pasáží (< 20 pasáží). Zlikvidujte nadbytečné buňky. Pravidelně kontrolujte kontaminaci mykoplazmou. Vysejte buňky den před transfekcí podle konfluence doporučené poskytovatelem transfekčního činidla.

 

Dodržujte protokol transfekčního činidla.

Některá činidla jsou sérem nebo antibiotiky inhibována, zatímco jiná mohou být použita v médiu, které právě séra a antibiotika obsahuje, čímž se snižuje riziko toxicity a počet kroků v protokolu. Zkontrolujte doporučenou konfluenci buněk, stejně tak doporučené množství DNA a objem činidla.

 

Pracujte s kvalitně připravenou DNA.

Kontrolujte kontaminaci RNA elektroforézou na agarózovém gelu a barvením ethidiumbromidem. Změřte UV absorbanci při 280 nm. Poměr OD 260 / 280 by měl dosáhnout alespoň 1,8. Resuspendujte plazmid v deionizované vodě nebo TE pufru při koncentraci cca 1 g/ l. Připravený plazmid rozdělte do alikvotů a skladujte jej při -20 ° C, aby se zabránilo zbytečným cyklům zmrazení / rozmrazení.

 

Zkontrolujte kvalitu séra.

Některé šarže séra mohou drasticky inhibovat účinnost transfekce, což má za následek nižší účinnost utlumování genů. Před zakoupením nové dávky séra tedy zkontrolujte účinnost transfekce různých šarží séra. Zajistěte také, aby použité médium umožňovalo účinnou transfekci, protože některá složka média může snižovat účinnost transfekce.

 

Minimalizujte cytotoxicitu použitím malého množství DNA a malého objemu transfekčního činidla.

Zkontrolujte, zda cílový gen neovlivňuje životaschopnost buněk. Analyzujte transfekci v dřívějším časovém bodě (například 24 hodin po transfekci místo 48 hodin).

 

Použijte vhodné kontroly.

Pomocí reportérového genu nastavte a optimalizujte podmínky transfekce, protože ty se mohou v závislosti na buňkách, které mají být transfekovány, lišit. Na trhu jsou komerčně dostupné různé reportérové systémy: nejčastěji se používají Renilla Luciferase a GFP (Green Fluorescent Protein).

 

Firma Polyplus-transfection pro vás vytvořila databázi, kde můžete najít optimální podmínky pro transfekci svých buněk:

https://www.polyplus-transfection.com/resources/cell-transfection-database/

 

(Zdroj originálního textu: Polyplus transfection. Redakčně upraveno.)

Incucyte® – Využijte analýzu živých buněk uvnitř vašeho inkubátoru

Incucyte® – Využijte analýzu živých buněk uvnitř vašeho inkubátoru

Seznamte se s platformou Incucyte společnosti Sartorius a zjistěte, ve které variantě by byl nejvhodnější pro Vaši laboratoř!

více informací
Workshop a prezentace přístrojů Sartorius – Praha a Hradec Králové

Workshop a prezentace přístrojů Sartorius – Praha a Hradec Králové

Srdečně Vás zveme na workshop a prezentaci Sartorius Octet N1 v pondělí 7.11.2022 v Hradci Králové a workshop a prezentaci Incucyte a Octet ve středu 9.11.2022 v Praze.

více informací
Představujeme Corning® Lambda™ EliteMax, poloautomatický stolní pipetor

Představujeme Corning® Lambda™ EliteMax, poloautomatický stolní pipetor

Stolní pipetor Corning Lambda EliteMax Benchtop Pipettor je poloautomatický, cenově dostupný a snadno použitelný manipulátor kapalin pro laboratorní stoly, které jsou omezené na prostor, ale vyžadují výkon a schopnost provádět vysokokapacitní screeningy pro velké objemy testů. Více se dočtete v následujícím textu.

více informací