10 nejčastějších chyb při počítání buněk

(Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

 

Ruční počítání buněk je přímočaré a poměrně nenákladné; přesto při něm může snadno docházet k chybám.

 

Někteří vědci stále upřednostňují ruční počítání buněk pomocí hemocytometrů; manuální počítání buněk je však pracné a často jde o neefektivní využití času. Experimenty by měly být prováděny s přesností a precizností, a to platí jak pro sbírání, kvantifikaci, tak i analýzu vzorků buněk.

 

Ruční počítání buněk je přímočaré a poměrně nenákladné; přesto při něm může snadno docházet k chybám. Získání znalosti základů počítání buněk – stejně tak jako nejčastějších chyb v počítání buněk a toho, jak se jim vyhnout – může trvat velmi dlouho, než se konečně zajistí co nejefektivnější využití času stráveného v laboratoři.

 

Časté chyby při počítání buněk

 

1. Chyby přístrojů

Hemocytometry postrádají nejnovější vizualizační technologii běžnou u pokročilejších zařízení. Automatizovaná počítadla buněk, jako je Corning® Cell Counter, mohou rychle zpracovávat obrázky na tabletu nebo počítači a nabízejí tak rychlejší analýzu v digitálním formátu, který je mnohem přesnější než tradiční vizualizační metody.

 

2. Manuální chyby

Ruční počítání buněk závisí na vizualizaci experimentátora, což je vlastnost, která je čas od času náchylná k nepřesnostem. Může dojít k nesprávné vizualizaci vzorku kvůli řadě faktorů, jako je agregace buněk, přítomnost úlomků nebo problémy se zrakem. To může způsobit významné výkyvy v počtu buněk, což vede k nepřesné reprezentaci skutečné buněčné suspenze. Automatizované počítadlo buněk je navrženo tak, aby detekovalo a vizualizovalo buňky přesně a s vysokou precizností.

 

3. Hustota buněk

Použití příliš nízké nebo příliš vysoké hustoty buněk je obecně spojovánno s chybami v počítání, zejména při použití tradičního hemocytometru. Pokud je hustota buněk příliš nízká, buňky v poli nemusí zcela přesně reprezentovat zásobní roztok. V situaci, kdy je hustota buněk naopak příliš vysoká, se mohou buňky shlukovat, což může také vést k závažným chybám v počítání.

 

4. Příprava vzorku

Když je počítací komůrka hemocytometru naplněna kapalinou, dochází mezi komůrkou a krycím sklíčkem k mírnému zvětšení prostoru. Poté může dojít k chybě v odhadu objemu. Pipetování suspenze buněk do počítacího sklíčka může také způsobit podobné chyby. Různá vlákna nebo vzduchové bubliny ve vzorku pak mohou také způsobit chyby v počítání buněk.

 

5. Nedostatečné promíchání vzorku

Když stojí suspenze buněk ve zkumavce delší dobu, mnoho buněk v suspenzi se bude pohybovat směrem k její spodní části. Vzorek odebraný z této zkumavky tak nebude reprezentovat skutečnou hustotu roztoku a povede k nepřesným hodnotám počtu buněk. Před počítáním je proto důležité vzorky dobře resuspendovat. Tímto způsobem dosáhnete vyšší přesnosti během počítání buněk.

 

6. Nerozlišování buněk od úlomků buněk

Dokonce i pro vysoce trénované oko se mohou někdy buněčné úlomky jevit jako další buňka ve vzorku. Existuje určitá šance, že budou v roztoku buněčné úlomky přítomny, a pokud se tyto úlomky počítají jako buňky, vede to k falešně pozitivním výsledkům. Ruční počítadla buněk někdy naopak nesprávně klasifikují buňku jako úlomek, což má za následek naopak falešně negativní výsledek. Automatizovaná počítadla buněk obvykle používají specifické detekční parametry, které snižují pravděpodobnost, že vznikne významné množství falešně pozitivních nebo falešně negativních výsledků.

 

7. Nestandardizované protokoly

Protože provádějí ruční počítání buněk různí lidé, každý protokol pro počítání buněk ve vzorku bude závislý na individualizovaném přístupu, který je náchylný k variacím. Tyto variace mohou způsobovat značné chyby, pokud protokoly nejsou standardizovány skrze celý výzkumný tým. Detekce pomocí automatizovaného počítadla buněk je založena na vlastnostech, se kterými algoritmus pracuje, aby určil, které vlastnosti vzorku se „shodují“. Navíc pracuje na základě jednoho protokolu, což eliminuje potřebu další práce spočívající ve vytváření a udržování přísné strategie počítání.

 

8. Neefektivní záznamy a monitorování

Při použití ručních metod operátoři jednoduše zapisují počet buněk do svého laboratorního deníku. Technologický pokrok umožnil rychlejší přístupy k počítání a zaznamenávání údajů. Výhodou mnoha automatických počítadel buněk, jako je Corning® Cell Counter, je jejich schopnost využívat cloudovou technologii pro zaznamenávání a sdílení dat.

 

9. Matematické chyby

Ať už se jedná o jakýkoliv typ sběru dat, vždy se s ním pojí využití velkého dílu matematických úkonů. Využití matematiky je při výpočtu průměrného počtu buněk v suspenzi zásadní. Matematika počítaná ručně je časově náročná a je také náchylná k chybám. Některé automatizované systémy pro počítání buněk, jako je Corning Cell Counter, vypočítávají hustotu buněk a procentuální životaschopnost vzorku téměř okamžitě.

 

10. Důvěra v to, že ruční počítání je jedinou vyzkoušenou a důvěryhodnou metodou

Ačkoli se ruční počítání buněk může jevit jako univerzální a adaptabilní v různých situacích, jeho užitečnost je ve skutečnosti omezena operátorem. Větší množství počtů buněk při experimentech s vyšší výtěžností (high throughput) lze snadněji provádět pomocí automatizovaných počítadel buněk, což snižuje pravděpodobnost chyby a současně zlepšuje produktivitu napříč celým experimentem.

 

Jsou automatická počítadla buněk nízkonákladová?

 

Přinejmenším zpočátku je hemocytometr poměrně levným řešením. Mnoho vědeckých zařízení spoléhá na ruční počítání a věří, že bude nízkonákladové; avšak potřebné školení, čas potřebný ke standardizaci protokolu a chyby, které ruční počítání produkuje, však vedou ve srovnání s automatizovaným počítáním buněk k mnohem větším dlouhodobým nákladům, než se obvykle očekává. Jednorázová investice do automatizovaného počítadla buněk vám zajistí, že v laboratoři nebude zbytečně plýtván čas, což povede ke zlepšení dlouhodobé efektivity nákladů.

 

Závěr

 

Automatická počítadla buněk umožňují rychlejší a spolehlivější počítání buněk s vyšší výtěžností, což vědcům umožňuje nasměrovat jejich zaměření na další důležité oblasti jejich práce.

 

(Zdroj originálního textu: Corning. Redakčně upraveno.)

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací