<<<   Výběr detekčního systému                obsah           Sekundární protilátky   >>>

Volba detekčního postupu pro IF

Detekční činidla pro imunofluorescenci se používají k lokalizaci a vizualizaci cílových antigenů exprimovaných v tkáňových řezech nebo kultivovaných buňkách. Při optimálním použití poskytují tato vysoce specifická činidla definovaný kontrast mezi jejich fluorescencí, která vymezuje antigen, a nefluorescenční oblastí řezu. Existuje několik možností, jak dostáhnout značení jednoho a více antigenů.

Přímá detekce

Běžná IF metoda používá primární protilátku konjugovanou s fluoroforem. Tento přímý přístup umožňuje rychlou a snadnou vizualizaci, pokud je k dispozici primární protilátka konjugovaná. Existují však určité nevýhody tohoto tradičního způsobu. Například afinita a avidita protilátky může být procesem konjugace narušena, což by snížilo signál a zabránilo detekci středně nebo slabě exprimovaných antigenů. Navíc drahé primární protilátky používané ve vysokých koncentracích by mohly být nákladné a možnosti vizualizace jsou poté omezeny pouze na jeden fluorofor.

Nepřímá detekce (Jeden krok)

Nepřímá metoda, která používá značené sekundární protilátky, produkuje spolehlivé, reprodukovatelné a ekonomické výsledky IF. Tato metoda se vyhýbá nevýhodám přímo konjugovaných primárních protilátek a poskytuje amplifikaci signálu, která je nezbytná pro většinu značení buněčných a tkáňových řezů. Tato jednokroková metoda detekce je modulární a umožňuje jednoduchou substituci sekundárního ligandu různými konjugáty fluoroforu. Celou řadu koncentrovaných činidel naleznete v tabulce 2 na straně XX. Sekundární protilátky konjugované s fluoroforem jsou doporučeny tam, kde se očekává střední až vysoká exprese cílového antigenu.

Nepřímá detekce (Dva kroky)

Další amplifikace signálu je možno docílit použitím biotinylovaných sekundárních protilátek s konjugáty avidinu a streptavidinu. Tato dobře zavedená a široce publikovaná metodologie využívá velmi vysokou afinitu mezi avidinem nebo streptavidinem a malým vitamínem biotinem. Tato dvoustupňová metoda detekce umožňuje detekci slabě exprimovaných antigenů a poskytuje flexibilní a modulární systém s jednoduchou volbou fluoroforu s použitím různých konjugátů avidinu a streptavidinu (viz strany 18-20). Další amplifikace může být dosaženo použitím biotinylovaného anti-avidinu/streptavidinu. Pro aplikace, kde by použití biotinových činidel pro zesílení signálu bylo problematické, nabízíme nebiotinový dvoustupňový fluorescenční protokol s našimi soupravami VectaFluor Excel Amplified DyLight Antibody (viz str. 16).

 

cytokeratin 14, zelená cytokeratin 18, červená Barvení kolonie
Barvení kolonie-tvořících buněk v kultuře karcinomu prsu. Bazální (cytokeratin 14, zelená) a luminální markery (cytokeratin 18, červená). Obrázek poskytla Wendy Greenwood, metoda Dr. Michaela Pratera, The Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, UK.

 

Hypoxie v hyperplastické CAIX imunofluorescence VECTASHIELD HardSet Antifade
Hypoxie v hyperplastické tkáni prsu. Část lidské tkáně prsu označená CAIX pomocí imunofluorescence, kontrastně barvená a zamontovaná do VECTASHIELD HardSet Antifade montovacího media s DAPI. Obrázek poskytl Dr. Carl Daly a Dr. Sarah Deanová, Healthcare Science, University of the West of England, Bristol, UK.
 T-buňky (modrá) B-buňkami (purpurová) Reakce zárodečného centra (GC
Reakce zárodečného centra (GC) ve slezině po akutní virové infekci. Po rozpoznání virových antigenů, migrují T-buňky (modrá) z T-buněčné zóny do folikulu, kde interagují s B-buňkami (purpurová). T-lymfocyty „pomáhají“ B-lymfocytům a řídí v GC (zelená) selekci virově specifických B-buněk, přepínání tříd Ig a somatickou hypermutaci k sekreci antivirových protilátek k boji s infekcí. Práci provedla Miriam Eckstein a Dr. Martin Vaeth, Department of Pathology, New York University, NY, USA.

 

Druhová krosreaktivita

Kromě možností uvedených v Průvodci výběrem (str. 4-5) je potřeba zvážit druh zkoumané tkáně a druh primární protilátky. V případech blízce příbuzných druhů se doporučuje použít sekundární protilátku, která byla specificky absorbována k odstranění zkříženě reagujících protilátek. V případech, kdy se myší primární protilátka aplikuje na řezy myší tkáně, se doporučuje použít M.O.M. systém (viz str. 22-23).

Značení více antigenů

Vizualizace dvou a více antigenů na stejném tkáňovém řezu vyžaduje pečlivé plánování a specifický výběr činidla, aby se vytvořily jednoznačné a reprodukovatelné výsledky barvení. Nedávno Vector představil VectaFluor Duet IF kity pro dvojité značení, které poskytují pohodlný a jednoduchý přístup k této často obtížné a časově náročné aplikaci (viz str. 15).

Výběr fluoroforů

Imunofluorescenční detekční činidla jsou označena fluorofory, které absorbují (excitace) a emitují (emise) světlo při specifických vlnových délkách. Fluorofory vhodné pro imunofluorescenci jsou dostupné v celém spektru viditelného světla. Světelný zdroj a filtrační kostky v použitém mikroskopu musí odpovídat požadavkům na excitaci a emisi specifického fluoroforu, aby se dosáhlo optimálního poměru signálu k šumu. Například absorpční a emisní maxima vlnové délky fluoresceinu jsou 495 a 515 nm. Proto excitační zdroj blízký 495 nm, poskytne největší emisní signál. Emisní filtr, který přesahuje 515 nm, zachytí emitovaný signál. Tyto vlnové délky jsou pevnými vlastnostmi fluoroforů a filtrů, a když jsou správně spárovány, systém přinese nejsilnější signál a nejnižší šum na pozadí.

Tabulka 1. Excitační a emisní vlnové délky a k nim přiřazené barvy viditelného spektra používaných fluoroforů.

 

Fluorofor                                 Barva                                            Excitace Max (nm)             Emise Max (nm)

AMCAModrá350450
DyLight 488Zelená493518
FluoresceinZelená495515
Cy3Oranžová550570
RhodamineOranžová550575
DyLight 549Oranžová562576
PhycoerythrinČervenoranžová565574
DyLight 594Červená593618
Texas RedČervená595615
Cy5Vzdálená červená649670
DyLight 649Vzdálená červená652672

 

<<<   Výběr detekčního systému                obsah           Sekundární protilátky   >>>

 

Máte další otázky?
Ozvěte se nám.
Mgr. Zuzana Manhartová

Mgr. Zuzana Manhartová

+420 735 177 202
zmanhartova@baria.cz