<<<   Výběr detekčního systému                obsah           Sekundární protilátky   >>>

Volba detekčního postupu pro IF

Detekční činidla pro imunofluorescenci se používají k lokalizaci a vizualizaci cílových antigenů exprimovaných v tkáňových řezech nebo kultivovaných buňkách. Při optimálním použití poskytují tato vysoce specifická činidla definovaný kontrast mezi jejich fluorescencí, která vymezuje antigen, a nefluorescenční oblastí řezu. Existuje několik možností, jak dostáhnout značení jednoho a více antigenů.

Přímá detekce

Běžná IF metoda používá primární protilátku konjugovanou s fluoroforem. Tento přímý přístup umožňuje rychlou a snadnou vizualizaci, pokud je k dispozici primární protilátka konjugovaná. Existují však určité nevýhody tohoto tradičního způsobu. Například afinita a avidita protilátky může být procesem konjugace narušena, což by snížilo signál a zabránilo detekci středně nebo slabě exprimovaných antigenů. Navíc drahé primární protilátky používané ve vysokých koncentracích by mohly být nákladné a možnosti vizualizace jsou poté omezeny pouze na jeden fluorofor.

Nepřímá detekce (Jeden krok)

Nepřímá metoda, která používá značené sekundární protilátky, produkuje spolehlivé, reprodukovatelné a ekonomické výsledky IF. Tato metoda se vyhýbá nevýhodám přímo konjugovaných primárních protilátek a poskytuje amplifikaci signálu, která je nezbytná pro většinu značení buněčných a tkáňových řezů. Tato jednokroková metoda detekce je modulární a umožňuje jednoduchou substituci sekundárního ligandu různými konjugáty fluoroforu. Celou řadu koncentrovaných činidel naleznete v tabulce 2 na straně XX. Sekundární protilátky konjugované s fluoroforem jsou doporučeny tam, kde se očekává střední až vysoká exprese cílového antigenu.

Nepřímá detekce (Dva kroky)

Další amplifikace signálu je možno docílit použitím biotinylovaných sekundárních protilátek s konjugáty avidinu a streptavidinu. Tato dobře zavedená a široce publikovaná metodologie využívá velmi vysokou afinitu mezi avidinem nebo streptavidinem a malým vitamínem biotinem. Tato dvoustupňová metoda detekce umožňuje detekci slabě exprimovaných antigenů a poskytuje flexibilní a modulární systém s jednoduchou volbou fluoroforu s použitím různých konjugátů avidinu a streptavidinu (viz strany 18-20). Další amplifikace může být dosaženo použitím biotinylovaného anti-avidinu/streptavidinu. Pro aplikace, kde by použití biotinových činidel pro zesílení signálu bylo problematické, nabízíme nebiotinový dvoustupňový fluorescenční protokol s našimi soupravami VectaFluor Excel Amplified DyLight Antibody (viz str. 16).

—

—

Druhová krosreaktivita

Kromě možností uvedených v Průvodci výběrem (str. 4-5) je potřeba zvážit druh zkoumané tkáně a druh primární protilátky. V případech blízce příbuzných druhů se doporučuje použít sekundární protilátku, která byla specificky absorbována k odstranění zkříženě reagujících protilátek. V případech, kdy se myší primární protilátka aplikuje na řezy myší tkáně, se doporučuje použít M.O.M. systém (viz str. 22-23).

Značení více antigenů

Vizualizace dvou a více antigenů na stejném tkáňovém řezu vyžaduje pečlivé plánování a specifický výběr činidla, aby se vytvořily jednoznačné a reprodukovatelné výsledky barvení. Nedávno Vector představil VectaFluor Duet IF kity pro dvojité značení, které poskytují pohodlný a jednoduchý přístup k této často obtížné a časově náročné aplikaci (viz str. 15).

Výběr fluoroforů

Imunofluorescenční detekční činidla jsou označena fluorofory, které absorbují (excitace) a emitují (emise) světlo při specifických vlnových délkách. Fluorofory vhodné pro imunofluorescenci jsou dostupné v celém spektru viditelného světla. Světelný zdroj a filtrační kostky v použitém mikroskopu musí odpovídat požadavkům na excitaci a emisi specifického fluoroforu, aby se dosáhlo optimálního poměru signálu k šumu. Například absorpční a emisní maxima vlnové délky fluoresceinu jsou 495 a 515 nm. Proto excitační zdroj blízký 495 nm, poskytne největší emisní signál. Emisní filtr, který přesahuje 515 nm, zachytí emitovaný signál. Tyto vlnové délky jsou pevnými vlastnostmi fluoroforů a filtrů, a když jsou správně spárovány, systém přinese nejsilnější signál a nejnižší šum na pozadí.

Tabulka 1. Excitační a emisní vlnové délky a k nim přiřazené barvy viditelného spektra používaných fluoroforů.

<<<   Výběr detekčního systému                obsah           Sekundární protilátky   >>>