<<< IF průvodce výběrem       obsah         Výběr detekčního systému >>>

Mezníky v technologii IHC/IF

Pozorování je jedním ze základních procesů vědeckého zkoumání. Celá staletí bylo studium tkání omezeno na pozorování disekce pouhým okem (hrubá anatomie).

To vše se změnilo v 17. Století, kdy Anton Van Leeuwenhoek vynalezl mikroskop, který umožňoval pozorování tkání na buněčné úrovni, čímž vytvořil histologickou vědu. Vědci brzy zjistili, že je poměrně jednoduché rozlišovat buněčné hranice a subcelulární kompartmenty v rostlinách. Zjistili také, že v živočišné tkáni to představuje mnohem větší výzvu. Zavedením barviv jako je hematoxylin v 19. století se stala subcelulární struktura živočišných tkání viditelnou a rozvinula se histochemie.

Počet dostupných tkáňových barviv se na počátku 20. století značně zvýšil a to napomohlo k identifikaci molekulárních rodin, které byly identifikovány. Schopnost identifikovat jednotlivé buněčné nebo tkáňově specifické proteiny však zůstala nepolapitelná. To se změnilo v polovině 20. století, kdy dr. Albert Coons prokázal, že fluorescenčně značené protilátky by mohly být použity k lokalizaci bakterií uvnitř makrofágů. V příštích dvou desetiletích se rychle rozvíjí chápání protilátek, antigenů a imunologie. IHC zůstala jako velice specializovaný výzkumný nástroj zejména na půdě univerzit. Na konci šedesátých let pak dr. Stratis Avremeas a dr. Paul Nakanenezávisle vyvinuli metody kovalentního spojení enzymu křenové peroxidázy (HRP) s protilátkami. HRP v přítomnosti diaminobenzidinu a peroxidu vodíku vytváří hnědou sraženinu v místě HRP-konjugované protilátky. Sraženina může být vizualizována pomocí běžného světelného mikroskopu. To umožnilo, aby výsledky IHC byly pozorovány v jakékoli laboratoři, která má světelný mikroskop, bez nutnosti drahých, komplikovaných fluorescenčních přístrojů.

Využití IHC jako výzkumného nástroje v příštím desetiletí dramaticky vzrostlo. Tato technika začala být používána v klinických zařízeních ve velkých univerzitních nemocnicích. Systém HRP testu byl dále vylepšen na počátku 80. let, kdy dr. Su-Ming Hsu ukázal, že vysoká afinita avidinu k biotinu může být použita ke zvýšení stability komplexu enzymových protilátek a ke zlepšení citlivosti testu. Společnost Vector Laboratories se podílela na vývoji v IHC komercializací těchto klíčových technologií. V následujících dvou desetiletích dominovalo na trhu použití IHC detekčních systémů založených na avidinu a biotinu.

Doposud byla vizualizace pomocí fluorescenční mikroskopie náročná vzhledem k rychlému fotobleachingu fluoroforů při vystavení světlu mikroskopu. To významně omezovalo dobu, po kterou mohl být vzorek pozorován. Začátkem devadesátých let představil Vector Laboratories VECTASHIELD Antifade montovací médium jako první komerčně dostupný nosič pro fluorescenci. Nejenže neměl žádnou autofluorescenci (v populárních vizualizačních kanálech), ale byl také účinný při prevenci fotobleachingu nebo blednutí fluoroforů. Pokroky v mikroskopii nejenže usnadnily získávání a analýzu obrazu, ale také poskytly výzkumným pracovníkům nástroje, které posunuly limity detekce fluorescence.

V posledním desetiletí byly imunofluorescenční aplikace dále vylepšeny adaptací nových super-rozlišovacích metod. Mikroskopie s vysokým rozlišením umožňuje zobrazení na měřítko menší než 200 nm. Vzhledem ke svým vlastnostem a jednoduchému použití bylo zjištěno, že montážní médium VECTASHIELD je velmi vhodné pro zobrazovací techniky s vysokým rozlišením, jako je stochastická optická rekonstrukční mikroskopie (STORM) a strukturovaná světelná mikroskopie (3D-SIM). Olivier, et al., popisuje VECTASHIELD montážní médium jako „jednoduchý, ale výkonný pufr pro 3D-STORM“.

<<< IF průvodce výběrem        obsah         Výběr detekčního systému >>>

Máte další otázky?
Ozvěte se nám.
Mgr. Zuzana Manhartová

Mgr. Zuzana Manhartová

+420 735 177 202
zmanhartova@baria.cz