Validujte své protilátky

vytvořeno: 17.10.2019

Na úvod bychom s vámi rádi sdíleli záznam z webináře, ve kterém odborníci poskytují rady ohledně toho, jak lze vyřešit běžné problémy spojené s používáním protilátek, a také, co by se mělo udělat na úrovni vědecké komunity pro řešení tohoto problému obecně. Zazní tato témata:

úskalí práce s protilátkami
jak poznat kvalitní protilátku
správné použití kontrol
proč je nezbytné protilátky validovat
potřeba přísnějších směrnic a minimálních standardů

Uslyšíte v něm tyto řečníky:

Dr. C. Glenn Begley
Chief Scientific Officer and Senior Vice President
Research & Development
TetraLogic Pharmaceuticals

Dr. David L. Rimm
Professor
Departments of Pathology and Medicine
Yale University School of Medicine

Dr. Anita Bandrowski
Center for Research in Biological Systems
University of California, San Diego
Project Lead
Neuroscience Information Framework

<<< na záznam z webináře se dostanete kliknutím na tento odkaz >>>

Věděli jste, že:

Protilátky jsou nejběžnějšími reagenciemi ve výzkumných a klinických laboratořích pro:

 Western Blot
Imunohistochemii
Imunocytochemii
Kvantitativní imunofluorescenci
• ELISU
Imunoprecipitaci
Chromatinovou imunoprecipitaci
Průtokovou cytometrii

Odhaduje se, že je zde více než 300 společností, které prodávají více než 2 miliony protilátek pro výzkumné a klinické trhy (www.antibodyresource.com/onlinecomp.html, www.citeab.com).

Pokud jde o použití ve výzkumu, neexistují žádné standardní pokyny pro výrobu, validaci a používání protilátek. Co se tedy stane, pokud nebudete protilátky validovat?

Získáte nesprávná, zavádějící data
 Vaše výsledky nebudou reprodukovatelné

Při nákupu protilátek nespoléhejte pouze na:

 Tvrzení výrobce
 Důkaz ve formě Western blotu, který ukazuje 1 proužek v oblasti predikované molekulové hmotnosti

Konečná odpovědnost za validitu protilátky leží na vás, kupujících, nikoli na prodejci!

Nejdůležitější otázka, na kterou si musíte odpovědět: Detekuje protilátka zamýšlený protein v mém experimentu?

Před nákupem protilátky zodpovězte tyto důležité otázky!

Zeptejte se svého dodavatele:

 Je v dodaném produktovém listu uveden zamýšlený cílový protein, zdroj imunogenu, organismus hostitele, doporučená aplikace, doporučené počáteční ředění a pufry, relevantní protokoly a reference?
 Jsou poskytnuta data pro doporučené nebo kvalifikované aplikace a existuje popis metod použitých k validaci protilátky pro tyto aplikace?
Jsou validační údaje specifické pro konkrétní šarži?
 Jsou uvedena doporučení pro správné používání pozitivních a negativních kontrol?
 Byla testována reaktivita protilátky s endogenním proteinem?
 Je protilátka vyráběna a testována interně výrobcem nebo třetí stranou?
 Jsou poskytnuty odkazy a citace, které potvrzují daná tvrzení?
 Je pro tento produkt nabízena technická podpora?

Zeptejte se sami sebe:

 Bylo prokázáno, že protilátka reaguje s mým zvířecím organismem?
 V případě, že je epitop definován, má stejnou strukturu jako protein v mém zkoumaném organismu?
 Mohu použít své vlastní laboratorní protokoly nebo musím použít protokoly doporučené výrobcem?
• Jaká je koncentrace protilátky?
 Zahrnul jsem vhodné pozitivní kontroly (neexprimující buňky transfekované cílovým proteinem, buňky nadexprimující protein, buňky ošetřené cílenými aktivátory) a negativní kontroly (buněčná linie nebo tkáň, která neexprimuje protein, knockoutované buňky, siRNA nebo shRNA knockdownové kontroly, buňky ošetřené cílenými inhibitory)?
 Měl bych protilátku rozalikvotovat?
 Jaká je skladovací lhůta protilátky?
 Jak mám protilátku uchovávat?
 Zaznamenal(a) jsem si všechny důležité informace týkající se protilátky, jako je jméno výrobce, číslo šarže, katalogové číslo produktu, datum exspirace a podobně?
 Má protilátka stejnou šarži, kterou jsem použil(a) již dříve? Změnilo se doporučené ředění? Chová se obdobně jako předchozí šarže?

Podle aplikace, ve které bude protilátka použita, lze použít různé stupně validace.

Například imunohistochemický (IHC) test pro klinické účely bude vyžadovat vysoký stupeň validace protilátek na více úrovních:

 Jeden pruh detekovaný na western blotu vzorku lyzátu nebo imunoprecipitace v oblasti očekávané molekulové hmotnosti.
Snížení intenzity pruhu na WB a signálu v imunofluorescenčním testu při RNAi nebo chybějící signál v negativních tkáních nebo buněčných liniích.
Barvení je lokalizované, specifické a v souladu s literaturou.
 Výsledky protilátek jsou reprodukovatelné mezi šaržemi, experimenty a personálem.

Doporučené metody a kontroly k určení zda protilátka rozpoznává svůj zamýšlený cíl

 

WB IHC ICC ELISA IP ChIP FC
Je nížený signál ve vzorcích po siRNA knockdown?

  •  •  •  • 
Chybí signál ve vzorcích z knockoutované tkáně?

  • 
Chybí signál v přirozeně negativních buněčných liniích nebo tkáních?

•  •  • 
Dokáží dvě nebo více protilátek proti různým epitopům recipročně identifikovat cíl na IP western blotu?

       

 

Může úroveň exprese korelovat v jiném typu testu

(např. enzymatická aktivita, WB, IP, ELISA)?

•  •  •  • 
Vykazují dvě nebo více protilátek proti různorodým epitopům

relativně podobné výsledky?

•  • 
Je subcelulární lokalizace v souladu s literaturou?

     

 

Mění použití proteinových aktivátorů nebo inhibitorů

detekované posttranslační úpravy?

  • 
Odpovídá exprese a detekce epitopem značeného proteinu

výsledkům studií endogenního proteinu?

  •  • 

 

Je signál z izotypové kontroly nízký až negativní?

•  •  • 

 

Jsou výsledky reprodukovatelné mezi experimenty, šaržemi, personálem? •  •  • 

Project Advisors: Sharon Bonnette, PhD, Director of Antibody Validation and Quality Control, Bethyl Laboratories, Inc. Eric McIntush, PhD, Chief Scientific Officer, Bethyl Laboratories, Inc. Sponsored by: C. Glenn Begley, PhD, FRACP, TetraLogic Pharmaceuticals, Chief Scientific Officer and Senior Vice President, Research & Development David L. Rimm MD, PhD, Professor of Pathology, Director of Pathology Tissue Services, Yale University School of Medicine

 

 

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací