Technika zalévání zmrazené tkáně

kategorie: histopatologie
vytvořeno: 12.2.2019

TECHNIKA ZPRACOVÁNÍ ZMRAZENÉ TKÁNĚ

Tento článek popisuje systém zalévání tkání pro přípravu zmrazených řezů. Metoda se od běžného zalévaní na terče liší a je vhodná zejména pro tenké vzorky a tam, kde je nežádoucí větší skrajování tkáně. Je totiž založena na zalévání do ocelových zalévacích forem tkání dolů. Je to jednoduchý systém, který nabízí mnoho výhod oproti běžným metodám, včetně rychlosti, vysoké přesnosti a snižuje plýtvání tkání. Snadno se přizpůsobí na většině stávajících kryostatů a vyžaduje minimální údržbu.

 

Zalévání

Úvod

Přestože zalévání tkáně je v případech, kdy orientace vzorku není kritickým faktorem, jednoduchý proces, existují případy, kdy schopnost správně vyhodnotit vzorek závisí právě na dokonalé orientaci vzorku v bloku.

V běžných kryostatech je tkáň zalita tak, že je umístěna lícem nahoru na držák tkáně a překryta zalévacím médiem. Držák tkáně, či terč se poté vloží do mrazícího bloku v kryostatu, kde zmrzne. V některých kryostatech je možné na tkáň ve správném okamžiku přitisknout mrazící hlavu, která zároveň vzorek i zploští, aby nedocházelo ke zbytečným ztrátám tkáně. Tento systém má však několik nedostatků. Pracuje správně v situacích, kdy je k dispozici velký objem tkáně a přesná orientace není zásadním požadavkem. Vzorek může být skrojen na potřebnou úroveň. V některých případech je tato metoda nedostatečná, při zpracování je velmi důležitá vysoká přesnost a možnost tkáně orientovat. Pokud je takový vzorek zpracován standardní metodou zalití vzorkem nahoru s přitisknutí mrazící hlavy, výsledkem mohou být méně kvalitní vzorky, které vyžadují výrazné skrojení a mohou vést ke ztrátě důležitých struktur. U fragilních tkání může dojít až k rozdrcení tkáně a tím dodatečnému zkreslení tkáně preparátu. Zde prezentovaná metoda se blíží technice zalévaní do parafinu.

Ještě větší problém při namrazování nastává u malých a vícečetných vzorků a vzorků tenkých, u kterých je třeba tkáň orientovat.

Bylo vyvinuto mnoho technik, kterými si zkušení laboranti pomáhají k lepším výsledkům zalévání zmrazených vzorků.

Při zpracování zmrzlých tkání je kladen velký důraz na rychlost. Při použití konvenčního systému v moderních kryostatech může trvat 90 vteřin nebo více, než dojde ke zmrazení bloku. Aby se proces urychlil, používá se například ponoření tkáně do tekutého dusíku nebo se používá Cryospray. Tento rychlý proces má ale omezení v preciznosti.

Tuto metodu, která je precizní a snadná na provedení vytvořil Dr.  Stephen Peters prezident společnosti Pathology innovations, LLC, Wyckoff, NJ USA. Pro metodu je potřebný spotřební materiál popsaný níže.

 

Zalévací komůrky

Zalévání se provádí v jamkách z nerezové oceli o tloušťce 1 palec (obrázek 1A). Tyto ocelové zalévací komůrky je možné rychle vychladit na teplotu potřebnou k zmrazení tkáně. Jamky mají zkosené stěny, zaoblené hrany a leštěné plochy pro snadné uvolnění bloku. Autor používá čtvercové jamky se zaoblenými rohy se základnou o průměru 18, 24 a 30 mm. Jamky jsou uloženy v kryostatu v nejhlubším vhodném místě, kde jsou teploty nejnižší. Během procesu zalévání jsou přemístěny na vyšší nebo přístupnější místo. V mnoha kryostatech lze pro tento účel instalovat malou pracovní polici. Teplota kryostatu -23 až -27 °C funguje ideálně pro rychlé zmrazení.

 

Držáky vzorku – namrazovací terče

Namrazovací terče jsou navrženy jako čtvercové s ostře řezanými kanálky do tvaru mřížky pro maximalizaci uchopovací síly držáku (obrázek 1B). Mřížka umožní odtečení přebytečného média a šířka a hloubka kanálků umožňuje plošné proniknutí mrazícího média a zaručuje přilnutí k bloku. Terče jsou vyrobeny z nerezové oceli, maximalizující jejich mrazicí výkon a trvanlivost a měla by ideálně být uložena v krabičce na výhodném místně v kryostatu, protože umožňují proces uchycení zalité tkáně urychlit.

 

Chladící bloky

Tyto bloky jsou konstruovány z pravoúhlých ocelových kostek a působí jako odváděč tepla ze stopky držáku vzorku (obrázek 1C). Umisťují se na stopku terče a urychlují mrazení. Lehký tlak, který vyvíjí na blok pomáhá adhezi terče k bloku. Malý hřeben na stopce pouzdra štěpí rovinu adheze, která drží formovaný tvar bloku v jamce. Tyto bloky rovněž slouží jako vhodný rovný zmrazovací povrch při „omítkové technice“ popsané níže.

 

Špachtle na přenášení tkáně

Tenká průhledná vinylová špachtle slouží k přesné orientaci tkáně do požadované polohy a jako prostředek k přesnému přenášení tkáně na dno zalévací jamky (obrázek 1D). Tkáň se na něj položí lícem dolů tak, aby požadovaná část byla viditelná po otočení sklíčka lícem nahoru. Pak může být upravena do potřebné polohy, a nakonec i takto vložena do zalévací jamky.

 

Zalévací police

Tato odnímatelná vložka je navržena tak, aby mohla být nainstalována na pření stěně pod oknem kryostatu v nejvhodnější a ergonomicky pohodlné poloze (obrázek 1E). Police jsou vyrobeny v různých velikostech, aby vyhovovaly většině přístrojů. Do police se vejdou tři zalévací komůrky s jamkami, které mohou složit k zalití až 12 bloků. Pokud nechcete nebo není možné poličku používat, stačí komůrku položit jinam na pohodné místo v kryostatu, kde bude možné zalití provést.

 

Obrázek 1:

  1. (A) Zalévací komůrky s jamkami, s rozměry – 30 mm; 24 mm a 18 mm.
  2. (B) Držáky vzorku – terče. Nerezová ocel o rozměrech 36 a 28 mm.
  3. (C) Chladící bloky.
  4. (D) Špachtle na přenášení tkáně.
  5. (E) Zalévací police. Tato odnímatelná ocelová police poskytuje pohodlný a ergonomický pracovní prostor pro zalévání.

 

Technika zalévání

Orientace tkáně na špachtli

1. Naneste na špachtli malé množství zalévacího média (obrázek 2A).

2. Zorientujte tkáň podle potřeby a přeneste ji na špachtli tak, aby líc tkáně – část, kterou chcete mít v bloku na vrchu– směřoval dolů (obrázek 2B).

3. Po otočení špachtle o 180° uvidíte tkáň tak, jak bude vypadat v bloku. Pozici tkáně lze ještě upravovat (obrázek 2C).

 

Umístění tkáně do zalévací jamky.

1. Tkáň ze špachtle popotáhněte k okraji, aby asi o 1 mm přečnívala. Přibližte k jamce k místu, kde chcete mít tkáň přimrazenou.

2. Jakmile se přečnívající okraj tkáně dotkne dna jamky, okamžitě se díky mrazu a zalévacímu médiu přichytí na místo (obrázek 2D).

3. Pomalým tahem pak stáhněte ze špachtle zbytek tkáně.

 

Naplnění jamky zalévacím médiem

Naplňte jamku zalévacím médiem do maximální kapacity tak, aby se vytvořil meniskus přes okraj jamky (obrázek 2E).

 

Přilnutí bločku k držáku vzorku

Ihned po zalití vzorku zalévacím mediem, přitlačte k jeho vrcholu držák vzorku (obrázek 2F). Nadbytečné médium je vytlačeno kanálky ve vyřezané mřížce terče.

 

Umístění chladícího bloku

Chladící blok je třeba umístit na stopku držáku vzorku, ve chvíli, když použijete nevymrazený terč nebo zaléváte bloky v 30 mm jamkách. V těchto případech je třeba rychle vychladit držák vzorku i shora (obrázek 2G).

 

Doba mrazení

Optimální podmínky mrazení jsou uvedeny s ohledem na použití vymrazených držáků vzorku, vymrazených jamek skladovaných v kryostatu při teplotě -24 °C.

Optimální podmínky mrazení jsou následující:

Velikost jamkyDoba mrazení
18 mm20 s
24 mm35 s
30 mm60 s

 

Odstranění chladícího bloku

Blok sundejte ze stopky. Rychlým klepnutím chladícím blokem na stopku terče se blok uvolní z jamky (obrázek 2H a 2I).

Obrázek 2. Technika zalévání. (A) Nanesení média do tenké vrstvy na špachtli. (B) Tkáň je umístěna na konec špachtle v přesné poloze a orientaci; Tři proužky nabarvené tmavě pigmentované kůže, pouze hluboká vrstva (ne okraje); délka přibližně 15 mm x 1,5 mm na šířku a 1,5 mm hloubka. (C) Otočení špachtle, pro prohlédnutí lícové strany, která má být vložena do jamek. Tkáň může být dále manipulována do přesné polohy s důrazem na požadované. (D) Tkáň je mírně vytažena přes okraj špachtle a dotýká se dna jamky, kde přilne k chladné oceli. Ta je pak vytažena z pod tkáně. Vzorky, které vyžadují přesné umístění, lze zploštit, manipulovat a vést do požadované polohy, a to pomalým a opatrným pohybem. (E) Naplněná jamka. Meniskus je vyboulen nad povrch jamky. (F) Držák vzorku je umístěn nad hladkou plochou na povrch jamky. Nadbytečné médium je vytlačeno kanálky v mřížce terče. (G) Chladící blok nasazený na stopku terče. (H) Vyjmutí bloku zjamky. Blok je odloupnut od jamky pomocí ostré hrany chladícího bloku. (I) Hotový blok před prvním skrojením – je vidět zcela plochý povrch, který vyžaduje jen malý ořez. (J) Skrájený blok. Epidermis a inkoust jsou viditelné. (K) Fotografie zmrazeného bloku. Kompletní řez všech tří kusů. (L) Mikrofotografie kůže s dobře orientovanou epidermis a přehlednou hloubkou odebrané tkáně (zvětšení 50x).

 

Další podrobnosti o technice

Vinylové špachtle k orientaci vzorku

Je vhodné mít různé šířky špachtlí, které pasují do jamek různých velikostí. Pohled na tkáň skrz špachtli odpovídá tomu, jak ji uvidíme namrazenou v bloku a lze upravit její orientaci.

Příkladem může být požadavek při mrazení kožních vzorků, aby byla dobře viditelná epidermis nebo označený okraj tkáně. Použitím špachtle lze těmto situacím vyhovět. Po správné orientaci na špachtli je přimrazen vzorek v požadované poloze.

Tenká vrstva zalévacího média zajišťuje přilnutí tkáně na dno jamky a také snadné uvolnění bloku bez potrhání tkáně. Poskytuje oporu pro tkáň, se kterou díky tomu lze snadno manipulovat. Není žádoucí nanášet silnou vrstvu média, protože by vytvořila nerovný povrch na dně jamky a tenké jehlové biopsie nebo malé vícečetné vzorky by nepřilnuly ke dnu jamky ve stejné výšce. Obrázek 3 ukazuje umělecký příklad vyžadující extrémně ploché zalévání. Vzorky jsou v tomto případě barvená sezamová semena. Toho aby se sezamová semínka přilepila na dno jamky by se nedalo dosáhnout bez použití velmi tenké vrstvy vloženého média.

Obrázek 3. Kolo štěstí (A) Horní obrázek vlevo ukazuje barevná sezamová semena umístěná ve specifické orientaci na dně jamky o průměru 30 mm. (B) Vlevo dole je líc bloku právě vyjmutý z jamky. (C) Na pravé straně je znázorněna oříznutá plocha bloku.

 

 

Neexistuje-li riziko křížové záměny vzorků, může být do jednoho bloku umístěno několik kousků tkáně. Například při odběru vzorků z velkých tumorů mohou být umístěny až čtyři částky o průměru 1 cm do 30 mm jamky. To umožňuje krájení více vzorků z jednoho bloku najednou. Pokud je však třeba respektovat lokalizaci odběru tkáně – například u lymfatických uzlin, nelze tuto metodu použít, aby nedošlo k záměně vzorků v bloku.

 

Umístění tkáně do jamky

Před umístěním vzorku do jamky zvažte předem umístění tkáně v jamce. Pokud je na dno jamky umístěna velká část tkáně je třeba ji dobře přitisknout ke dnu jamky pinzetou. Pokud je délka tkáně 2 cm, jamka má průměr 30 mm, je vhodné tkáň umístit spíše k okraji jamky než na střed. Pokud budeme do jamky o průměru 30 mm umísťovat čtyři čtverečky tkáně o průměru 1 cm, měly by být umístěny tak aby se nedotýkaly a s cca 3mm volným okrajem (obrázek 4). Také je třeba zvážit orientaci tkáně k čepeli. Například epidermis by měla být při krájení kožních vzorků orientována kolmo na čepel.

Obrázek 4. Čtyři části tkáně, každá přibližně 1,0 cm, jsou snadno umístěny do jamky o průměru 30 mm pomocí vinylové špachtle. Všimněte si, že i když se tyto části tkáně značně liší v tloušťce, budou vloženy do roviny a vyžadují jen málo skrajování.

 

Použití vinylové špachtle umožňuje orientovat vzorek se značnou přesností. U vzorků, které nevyžadují žádnou orientaci, lze špachtli vytáhnout rychle. U vzorků vyžadujících přesnou orientaci je třeba tento proces provádět pomaleji a pečlivěji. Pokud to dovolí tvar vzorku, pak by měl být jeho nejdůležitější okraj přitisknut dolů jako první. Špachtle je pak pomalu vytahována z pod vzorku, přičemž za jemného tlaku pomocí pinzety, je zbývající část vzorku pečlivě přitlačena ke dnu jamky v požadované orientaci. V případě tenkých proužků kůže z Mohsovy operace je potřeba věnovat velkou pozornost tomu, aby byla epidermis zcela viditelná a tomu, aby byl vzorek položen v rovině. Vzorky, které vyžadují výrazné zploštění, mohou být jemně stisknuty pomocí hladké zahnuté pinzety. Vzorky trubic (močový měchýř, cévy…) lze snadno přichytit na dno jamky ve svislé orientaci. Fragmenty různých membrán mohou být zatočeny nebo složeny tak, aby stály na okraji dávkovacího sklíčka a vytaženy a uloženy ve stejné orientaci.

 

Manipulace s tekutými vzorky

Kapaliny a velmi měkké vzorky, jako jsou endometriální očistky nebo vzorky tkáně po abortu, mohou být sneseny do jamky plastovou lžičkou nebo špachtlí a umístěny úhledně do jamek bez rozdrcení (obrázek 5A a 5B).

Obrázek 5. Vzorky kapalin jsou snadno vlity do jamek, aniž by došlo k jejich rozdrcení. (A) Tekuté tkáně umístěné do jamky pomocí lžíce. (B) Zalitá kapalina tvoří trojrozměrný blok, který může být krájen

 

U velmi krvavých kapalných vzorků pomůže při namrazování přidat pár kapek zalévacího média přímo ke vzorku. Obrázek 6 znázorňuje příklad přesné manipulace s tekutinami pomocí tohoto systému.

Obrázek 6. Tekutiny. Umělecké zobrazení, které demonstruje jednoduchost zalévání kapalin, a to nejen v trojrozměrném bloku, ale také ve specifické orientaci. Kapaliny připravené ze zalévacího média barvené potravinářským barvivem.

 

Naplnění jamek zalévacím médiem a umístění držáku vzorků

Zalévací médium musíte vlévat do jamek tak, aby byl meniskus vypouklý a mohl vniknout do kanálků mřížky, vyřezané v terči držáku vzorků. Terč pak přitiskněte pevně k povrchu jamky. Přebytečné médium je kanálky vytlačeno ven. Tím se vytvoří pevné spojení bloku a držáku. Držák vzorků by měl být umístěn na jamku co nejrychleji po jejím naplnění zalévacím médiem.

 

Doby mrazení

Doporučené časy mrazení jsou pouze orientační, a počítají s plně vychlazenými jamkami a držáky vzorků. Doba mrazení je delší, pokud tyto nejsou vychlazené anebo pokud jsou vzorky velmi silné. Uživatel se brzy naučí odhadovat čas, kdy je blok připraven. Zalévací komůrky s jamkami by měly být, po použití, vráceny do dolní úrovně kryostatu, aby se udržela optimální teplota. Pro dosažení maximální efektivity metody je třeba po použití držáky vzorků dobře očistit, vysušit a uložit zpět do kryostatu k vychlazení. V kryostatu panuje značná variabilita teplot, podle toho, ve které úrovni od manipulačního okna se nacházíte. Zalévací police se instaluje do vyšší úrovně, aby bylo možné provádět kritické jemné ruční úkony. Při práci na zalévací polici se zalévací komůrky s jamkami, držáky vzorků nebo bloky zahřívají nad optimální pracovní teplotu.

 

Manipulace s více vzorky

Při manipulaci s více vzorky, které je třeba umístit do bloků samostatně, je díky tomuto systému zalévání možné tkáně zpracovat velmi rychle. Špachtle byste měly mít připravené předem. Držáky vzorků snadno označíte ihned po umístění na jamku. Pokud jsou terče dostatečně vychlazené, lze bloky přibližně 15 sekund před dokončením zmrznutí vyjmout z jamek. Proces mrazení je v bloku dokončen na jakémkoliv povrchu v dolní části kryostatu a vy můžete připravovat další vzorky. Pokud je třeba naplnit všechny čtyři jamky, doporučuje se nejdříve zalít dva bloky, ty vyndat z komůrek na domrazení. Následně pokračovat s dalšími dvěma vzorky. V době, kdy již potřebujete krájet první zalité bloky, jsou tyto již dostatečně vymrazené. Osm bloků lze takto zmrazit za méně než 2 minuty.

 

Vyjmutí hotového bloku z jamky

Chladící blok umístěný na stopce terče snadno bloky uvolní. Jeho ostrá hrana naruší soudržnost, která se vytváří mezi vychlazenou ocelí a zmrazeným médiem. Vyndat z jamky blok za stopku terče téměř není možné, protože přilnutí média k jamce je silné, zejména ve velkých jamkách. Díky použití hrany se blok uvolní s lehkostí.

Bloky zůstanou neporušené, i když nejsou zcela zamrzlé, za předpokladu, že povrch terče plně přimrznul k bloku.

Pokud se držák bloku na místě neudrží a vytáhne se, je to způsobeno buď nedostatečným naplněním jamky médiem, nebo použitím teplého upínacího pouzdra bez chladícího bloku. Jednoduchá a rychlá náprava situace je možná přidáním další vrstvy zalévacího média a přiložením nového vychlazeného terče k bloku.

 

Vyplňování defektů v bloku

Tato technika se používá k opravě jakýchkoli otvorů, defektů nebo štěrbin, které se mohou objevit na povrchu bloku připraveného touto metodou (obrázek 7). Občas se na povrchu bloku může vytvořit malý prostor mezi médiem, které pokrylo tkáň a médiem, které naplnilo jamku. Tento prostor je jen povrchový a bude rychle skrojen při krájení. Tam kde je přípustné pouze minimální skrojení, můžete tímto procesem vady vyplnit a získáte tak blok, který se bez těchto defektů bude lépe krájet. Obrázek 7A znázorňuje příklad povrchových nepravidelností, které lze vidět ve zmrazeném bloku. Technika se provádí následovně:

 

  1. • Použijte kapku zalévacího média na jakkoliv významnou vadu na horní plošce bloku (obrázek 7B).
  2. • Přitiskněte blok na mrazicí plochu (obrázek 7C).
  3. • Uvolněte pomocí hrany nebo blok vytáhněte (obrázek 7D).
  4. • Médium lze aplikovat přímo z lahvičky jako kapku. Pokud máte již blok upnutý před krájením, lze kapku přitlačit na blok chladícím blokem. Technika se dá využít i v případě, že se podařilo přimrazit tkáň příliš blízko okraji. Je tak možné pro lepší krájení přidat okraj ze zalévacího média k hraně bloku.

 

Obrázek 7. Technika doplnění média. (A) Plocha bloku zobrazující povrchové nepravidelnosti. (B) Malá kapka zalévacího média se aplikuje na plochu bloku. (C) Blok je okamžitě přitlačen na mrazicí plochu. (D) Hotový blok se zalitými defekty s malou vrstvou média na povrchu.

 

Orientace tkáně na nůž

Toto je mimořádně důležitý aspekt přípravy zmrazených řezů. Použitím systému vkládání vzorku do jamky je poměrně snadné připravit a orientovat tkáně v jamkách tak, aby se nůž potkal s tkání v určité orientaci. Na základě zkušeností platí následující pravidla:

1. Tuk by měl být poslední věcí, která narazí na čepel nože, nebo by měl být krájen po kraji samostatně (obrázek 8A a 8B). Tuk není při teplotách, které jsou dobré pro krájení většiny tkání, dostatečně tuhý. Když tuk narazí na čepel před jinou tkání, může dojít ke zničení zbytku vzorku. Při kladení vzorku do jamky je na to třeba myslet.

Obrázek 8. Orientace vzorku s tukovou tkání na čepel. (A) Blok nádoru prsu se značeným tukovým okrajem orientovaným kolmo k noži. Tuková tkáň je ukrojena vedle nádorové tkáně a okraj vzorku je nejlépe zachován na svislé části řezu. (B) Preparát z řezu, znázorňující viditelnou hranici resekce vlevo.

 

2. Nejkritičtější okraj tkáně by měl být kolmo nebo diagonálně na čepel. Neměl by být umístěn na začátku ani na konci řezu. Dívejte se na řez tak, jako by měl začátek, střed a konec. Na začátku hrozí nebezpečí pokroucení nebo poškození (používáte-li štětec nebo háček), případně mohou nastat problémy s tloušťkou, což jsou příležitosti pro artefakty. Podobně na konci se může stát, že se tkáň pokroutí nebo roztáhne při nanášení na sklo. Středovou částí prochází čepel nejsnáze. Je zde menší pravděpodobnost vzniku artefaktů.

3. Epitelové tkáně a tkáně sliznic, jako je kůže a vzorky z gastrointestinálního traktu, močový měchýř, děloha a děložní čípek, by měly být orientovány rovinou epitelu kolmo na čepel. Při zalévání má konec elipsy kůže, který potkává čepel první, tendenci se kroutit. Diagram na obrázku 9 znázorňuje přístup zalití malých elips kůže tak, aby na podélné okraje (2-5) narazila čepel naposledy.

Obrázek 9. Orientace epidermis na čepel. Na obrázku je znázorněna možnost přikrojení větší kožní biopsie a orientaci tkáně v bloku (2-5) tak, aby špička, která se má tendenci kroutí narazila na čepel jako poslední.

 

Je jasné, že existuje mnoho alternativ krájení, vycházejících z vašich zkušeností. Tato technika zalévání je schopná poskytnout vám možnost si vzorek orientovat dle potřeb pro snadnější krájení.

Diskuse a závěr

Tento systém zalévání tkání lícem dolů reprodukuje všechny výhody zalévání do parafinu, které se používá v rutinní histologii. Vlastnosti tkáně, která okamžitě přilne ke studené oceli, činí tento proces snadnější než zalévání do parafínu. Systém poskytuje značné výhody oproti dostupným metodám zalévání zmrazených bioptických vzorků, včetně rychlosti, přesnosti, menšího plýtvání tkání, snadného zaučení a pohodlí.

Rychlost, se kterou je možné získat řezy, se zlepší na několika úrovních. Příprava jednotlivých bloků je tímto způsobem podstatně rychlejší. Pomocí tohoto systému jsou bloky zmrazeny za 20s v malých jamkách a do 1 minuty ve velkých jamkách. Tento systém zvyšuje rychlost přípravy více bloků najednou. Jakmile jsou jamky naplněny, není třeba hlídat proces mrznutí vzorku, abyste zachytili správný okamžik přiložení tepelného extraktoru. Pokud musíte zpracovat více vzorků najednou z různých operačních místností, šetří tato technika zalévání drahocenný čas a v kryostatu je možné provádět další úkony, zatímco se bloky namrazují. Rychlost je také vylepšena tím, že nepotřebujete krájet více bloků. Velká jamka o průměru 30 mm umožňuje hodnotit širší tkáňové řezy nebo více vzorků najednou, které je možné umístit do jedné jamky. Další výhodou je, že všechny bloky jsou připraveny tak, aby byly ploché, nebo podobné tloušťky, přičemž upínací mechanizmus pro držák vzorku je přibližně rovnoběžný s plochou tkáně. To vede k menšímu ořezu bloků a menší potřebě přizpůsobit úhel držáku vzorků.

Zásadním rysem této techniky je možnost získat plochý blok s definovanou orientací tkáně, který zlepšuje možnost získat přesnou diagnózu. Umožňuje laborantovi orientovat vzorek přesně, požadovaným povrchem tkáně v rovině krájení. Pro tuto techniku se dříve užívaly plastové zalévací formičky. Výhodou této techniky oproti použití plastových forem, je přirozená vlastnost tkáně přilnout k vychlazenému kovovému povrchu – tkáň je snadno umístěna do libovolné polohy tím, že přilne na dno jamky. Plátky květů na obrázku 10 jsou jednoduše umístěny do kapky média a stojí proto na hraně.

Obrázek 10. Okvětní lístky postavené na svou hranu. Ozdobný blok s vykresleným zátiším vytvořeným vkládáním okvětních lístků a listů.

 

Tento systém rovněž zabraňuje vzniku nežádoucích artefaktů z rozdrcení tkáně, vznikajících při použití tepelného extraktoru v konvenčních kryostatech.

Díky plochému bloku, je snížena nutnost významně skrájet blok. Na obrázku 11 je blok s 51 semeny máku upravenými v jedné rovině. Pokud zvažujeme analogii toho, že jsme dostali 51 malých mozkových biopsií o velikosti máku, jaká je šance při použití konvenčních metod, že všech 51 biopsií by mohlo být zároveň v jednom zmrazeném řezu prokrojeno?

 

Obrázek 11. Hlemýžď z máku. Skrájený blok 51 makových semen zapuštěných ve spirále. V analogické situaci s použitím 51 drobných vzorků tkáně by mohla být na této úrovni odebrána zmrazená sekce při zachování všech 51 vzorků pro trvalou sekci.

 

Technologie je jednoduchá a lze se v jejím provádění lehce zacvičit. I laborant s malými zkušenostmi díky ní dokáže připravit vzorky, kterých nelze dosáhnout obvyklými metodami.

Umístění zalévací police pod přední otvor kryostatu maximalizuje pohodlí a efektivitu při zalévání. Systém využívá nástroje, které jednoduše fungují v přímo kryostatu. Nástroje jsou vyrobeny z nerezové oceli, která zajišťuje dlouhou životnost. Jediným potenciálně spotřebovávanými potřebami jsou vinylové špachtle. Jejich cena je ale nízká. Kromě zalévacího média není potřeba pořizovat drahý spotřební materiál, jako je například kapalný dusík nebo Cryospray. Pokud budete využívat zalévací polici, stačí jednoduše umístit dva šrouby na přední stěnu kryostatu. Tento úkon by měl být schopen zvládnout servisní technik.

Jedinou potřebnou údržbou je příležitostné otření jamek gázou navlhčenou v alkoholu. Příležitostně, v případech, kdy se do jamky umístí rozpadlé nekrotické tkáně nebo krvavé kapaliny, je potřeba jamky vyčistit. Obecně platí, že vrstva zalévacího média umístěného na dávkovacím sklíčku vytváří čistou rovinu štěpení. Jakékoli mikroskopické zbytky tkáně, které by mohly zůstat na dně jamky a mohly by se nalepit k dalšímu novému bloku, jsou oříznuty s prvním skrojením tkáně.