Průvodce řešením problémů pro qPCR

vytvořeno: 30.10.2019

Průvodce řešením problémů pro qPCR

Problém Možné řešení
Nízká nebo žádná fluorescence nebo vysoká hodnota Ct Pokud používáte sondu, může být nekompatibilní, špatně syntetizovaná nebo degradovaná. Zkuste použít různé sondy.

Ověřte, že údaje o fluorescenci jsou shromažďovány ve správném kroku

Postupně prodlužujte dobu nasedání primerů

Postupně snižujte teplotu nasedání primerů

Postupně prodlužujte dobu elongace

Velikost amplikonu by neměla přesáhnout 250 bp

Zvyšte množství templátu

Ujistěte se, že vzorek templátu neobsahuje inhibitory

Znovu purifikujte templát nebo ho rozřeďte

Zkontrolujte, zda používáte správné barvivo kompatibilní s vaší qPCR platformou („ROX“ nebo „bez ROX“)

Navyšte počet PCR cyklů

Ujistěte se, že je přístroj správně nastaven pro váš experiment

Přítomnost fluorescenčního signálu v negativní kontrole (bez templátu) Pravděpodobně se jedná o problém kontaminace. Postupujte podle obecných pokynů, abyste kontaminaci zabránili.
Nespecifická amplifikace Postupně zvyšujte teplotu nasedání primerů.

Dávejte pozor na dimery primerů. V případě potřeby upravte primery

 

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací