Průvodce řešením problémů pro qPCR
| Problém | Možné řešení |
| Nízká nebo žádná fluorescence nebo vysoká hodnota Ct | • Pokud používáte sondu, může být nekompatibilní, špatně syntetizovaná nebo degradovaná. Zkuste použít různé sondy.
• Ověřte, že údaje o fluorescenci jsou shromažďovány ve správném kroku • Postupně prodlužujte dobu nasedání primerů • Postupně snižujte teplotu nasedání primerů • Postupně prodlužujte dobu elongace • Velikost amplikonu by neměla přesáhnout 250 bp • Zvyšte množství templátu • Ujistěte se, že vzorek templátu neobsahuje inhibitory • Znovu purifikujte templát nebo ho rozřeďte • Zkontrolujte, zda používáte správné barvivo kompatibilní s vaší qPCR platformou („ROX“ nebo „bez ROX“) • Navyšte počet PCR cyklů • Ujistěte se, že je přístroj správně nastaven pro váš experiment |
| Přítomnost fluorescenčního signálu v negativní kontrole (bez templátu) | • Pravděpodobně se jedná o problém kontaminace. Postupujte podle obecných pokynů, abyste kontaminaci zabránili. |
| Nespecifická amplifikace | • Postupně zvyšujte teplotu nasedání primerů.
• Dávejte pozor na dimery primerů. V případě potřeby upravte primery |
podobné články
Prezentace produktů společnosti Akoya
Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.
více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya
Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.
více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories
Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)
více informací