PRŮVODCE IMUNOHISTOCHEMIÍ PRO ZAČÁTEČNÍKY

kategorie: imunohistochemie
vytvořeno: 24.6.2021

Pouštíte se do imunohistochemických experimentů úplně poprvé?

Nebo jste už s touto metodou seznámeni a hledáte další tipy? Hostující blogerka Sarah Etheridge hovoří o svých zkušenostech s experimenty IHC, které shrnula do deseti užitečných rad.

Imunohistochemie, neboli IHC, vám umožňuje vizualizovat proteiny v intaktní tkáni, která si zachovává svou morfologii, nebo jak ráda říkám – „naživo“. Jednou z výhod této vizualizace „naživo“ je, že umožňuje srovnání zdravých a nemocných tkání, takže aplikace je nedocenitelná jak pro vědce, tak pro patology. Protokol IHC je přímočarý, avšak obsahuje mnoho kroků, které mohou vyžadovat počáteční optimalizaci, aby se zajistila vazba specifické protilátky a optimální vizualizace cílového proteinu. Zde nastíním několik tipů pro každý z těchto kroků a zdůrazním ty, které mohou vyžadovat trochu vylepšení.

1. Příprava tkáně

Vzorky tkáně lze zmrazit nebo zafixovat. Zmrazení řezů obecně udržuje konformaci cílového antigenu, a tím umožňuje lepší vazbu protilátky. Ve tkáni se ale mohou tvořit malé ledové krystaly [1, 2], a tak řezy nemusí být dobrou volbou pro dlouhodobé skladování. Pokud chcete své vzorky ve sklíčkách uchovávat po delší období, je lepší alternativou fixovaná a zalitá tkáň. Nejběžnější metodou fixace a zalití tkáně je fixace formaldehydem a zalití do parafinu (FFPE). (Biopsie zalité do FFPE je možné uchovávat při pokojové teplotě neomezeně dlouho, což z nich dělá důležitý zdroj pro historické studie v medicíně!).

2. Příprava tkáně: Další věci k vyzkoušení

Fixace řezů tkáně před barvením pomocí ledově studeného 50:50 methanolu-acetonu (MeAc) nebo 4% paraformaldehydu (PFA) může zlepšit vazbu protilátky. MeAc například rozpouští cytoplazmatické proteiny, což umožňuje lepší vizualizaci proteinů vázaných na membránu.

3. Zpřístupnění antigenu

Fixace formaldehydem způsobuje zesíťování proteinů ve tkáni, udržuje morfologii tkáně, ale denaturuje epitopy rozpoznatelné protilátkou [3]. Zpřístupnění antigenu se proto obvykle provádí před barvením FFPE řezů, aby se odhalily skryté nebo denaturované cílové epitopy. Tento proces může být tepelně indukovaný nebo enzymatický [1, 4] s faktory, jako je teplota, pH a čas ovlivňující zpřístupnění antigenu. Je dobré otestovat „baterii“ nebo soubor metod zpřístupňování antigenu pro každou novou kombinaci protilátek a tkání, aby bylo možné určit optimální barvení a vyloučit jakékoli nespecifické barvení pozadí [5]. Dobrým výchozím bodem je vaření v pufru nízkého i vysokého pH, aby se určil optimální pretreatment. Použít lze vodní lázeň, či mikrovlnnou troubu. Vyšší pH obvykle poskytuje vyšší výtěžnost signálu. U zmrazených řezů není odmaskování antigenu nutné, ale řezy by měly být před barvením alespoň hodinu sušeny na vzduchu. Deparafinace FFPE řezů v xylenu a alkoholu musí být provedena před zpřístupněním antigenu a barvením; po odstranění parafínu se sekce rehydratují ve snižujících se úrovních alkoholu a poté vody, což mě vede k dalšímu skvělému tipu…

4. Manipulace se vzorky

Jakmile jsou řezy zbaveny parafínu a rehydratovány, je důležité nenechat je vyschnout! Použijte tedy speciální vlhkou komůrku na barvení IHC, ve které je uchováte během inkubace – komůrky jsou dostupné u mnoha prodejců a pomáhají udržovat tkáňové řezy ve vlhkém prostředí. Skvělý tip: Použijte parafínové PAP pero – speciální značkovací pero. Když jím vzorek zakroužkujete, vytváří tenkou hydrofobní bariéru podobnou filmu. Tím udržíte roztoky v blízkosti řezů poté, co byl proveden krok permeabilizace. Použití PAP pera není úplně nezbytné, ale může být užitečné. (Nepřidávejte krok PAP pera před permeabilizací nebo fixací MeAc, protože může být rozpuštěno Tritonem nebo MeAc a bude se vázat na vaši tkáň.)

5. Permeabilizace

U většiny proteinů je dobré přidat do protokolu krok permeabilizace. Pro transmembránové proteiny, jejichž epitopy jsou v extracelulární oblasti, nemusí být permeabilizace nutná. Permeabilizace zahrnuje inkubaci s detergentem (např. 0,1% Triton-X100 v PBS). Detergenty mohou také působit jako povrchově aktivní látky, které rozruší některá zesíťování proteinů, ke kterému dochází během fixace formaldehydem, a tak napomáhají navázání protilátek na správný epitop [1] a snižují nespecifické hydrofobní interakce. Skvělý tip: Pokud barvení nefunguje, zkuste do všech roztoků (zejména pro barvení FFPE) zahrnout malý přídavek detergentu, jako je Triton.

6. Blokování

Blokovací roztok se váže na nespecifická vazebná místa v tkáni [1], čímž brání nespecifické vazbě primárních a sekundárních protilátek na tkáňové složky. Řezy jsou inkubovány s „neškodným proteinovým roztokem“, jako je hovězí sérový albumin (BSA) nebo sérum od hostitele sekundární protilátky – obvykle začínám 3% roztokem BSA po dobu 20–30 minut. Proteintech také běžně používá 3% BSA, jako alternativu lze ale použít také 5–10% kozí sérum (protože sekundární protilátka, kterou Proteintech používá, je kozí).

 7. Výběr primární protilátky

Váš výběr primární protilátky by měl záviset na faktorech, jako jsou úrovně exprese sledovaného proteinu nebo jakékoli další protilátky použité v případě společné lokalizace. Pokud se jedná o více protilátek, je nutné použít protilátky různých druhů, aby bylo možné k jejich rozlišení použít různé sekundární protilátky s jedinečnými konjugáty. Musíte si také vybrat, zda jsou pro vaše potřeby vhodnější monoklonální nebo polyklonální protilátky; monoklonální poskytují vysoce specifický signál, zatímco polyklonální protilátky mohou poskytovat jasnější signál, zvláště pokud jsou hladiny exprese sledovaného proteinu nízké.

Kontroly protilátek

Při experimentu může dojít ke křížové reaktivitě a nespecifické vazbě jiných protilátek v hostitelském séru. Aby se tomu zabránilo, používají se techniky čištění, jako je čištění proteinem A / G, afinitní čištění nebo pre-absorpce. Proteintech čistí všechny své protilátky cílovým antigenem během přípravy produktu; pokud se však chystáte provádět kontroly k testování specificity vazby primárních protilátek, níže je uvedeno několik možností:

Ideální kontrolou je použít tkáň, která neobsahuje zájmový protein, například: tkáň z knock-out myši nebo buněk, kde je cílový protein sražen, tj. pomocí siRNA

Western blot se používá ke kontrole, že protilátka detekuje protein správné velikosti. Několik pruhů na Western blotu naznačuje nespecifickou vazbu protilátky.

Specifičnost protilátek lze ověřit preinkubací primární protilátky s antigenním peptidem (adsorpční test). Pokud je protilátka afinitně purifikována, není tento krok nutný. Pro purifikaci proteinu je totiž použita specifická peptidová sekvence [6].

Pokud je protilátka vyrobena na zakázku, proveďte Western blot test sérem z různých kroků výrobního procesu, abyste zjistili, zda je pás představující váš protein detekován správnými frakcemi.

8. Ředění protilátek

Průvodce ředěním je obvykle poskytnut s listem protilátky, jinak jsou ředění 1:50 až 1:300 dobrým výchozím bodem pro optimalizaci; můžete zkusit i panel ředění primárních protilátek s úplně novou protilátkou. Nařeďte primární protilátku v blokovacím roztoku (např. 3% BSA v PBS), poté inkubujte po dobu 1-2 hodin při pokojové teplotě nebo přes noc při teplotě 4 °C.

9. Promývání

Promyjte řezy po primární protilátce promývacím roztokem, jako je PBS. Mělo by stačit rychlé mytí následované třemi 5ti minutovými promytími. Zmrazené řezy mohou být dost křehké, proto pomalu kapejte roztok vedle řezu, např. pipetou o objemu 1 ml. Skvělý tip: Změňte promývací pufr na Tris pufrovaný fyziologický roztok (TBS) místo PBS.

Detekce: Detekce primární protilátky se obvykle provádí pomocí sekundární protilátky namířené proti imunoglobulinům hostitelských druhů primární protilátky, konjugovaných s fluorescenční (např. FITC) nebo chromogenní enzymatickou značkou (jako je křenová peroxidáza – HRP). Pro úspěšnou detekci postupujte podle těchto tipů!

Barvení pozadí se může lišit experiment od experimentu, takže je dobré provést negativní kontrolu, při které je primární protilátka v každém experimentu na jednom skle vynechána.

Nařeďte sekundární protilátku v blokujícím roztoku, obvykle v ředění přibližně 1: 800 – 1: 1000 (i když to lze následně upravit).

Použijte kit s polymerem navázaným HRP nebo AP, který poskytuje jeden z nejlepších poměrů signál/šum a eliminuje vliv sekundární protilátky na vznik nespecifického pozadí.

Pro fluorescenční experimenty:

Zkontrolujte, zda váš mikroskop detekuje fluorofor, který chcete použít. Je důležité vyhnout se spektrálnímu překryvu fluorochromů značících sekundární protilátku, křížovým reakcím mezi sekundárními protilátkami a rozptylu signálu při zobrazování.

Po přidání fluorescenčních protilátek udržujte řezy ve tmě, abyste zabránili vyblednutí.

Po inkubaci promyjte řezy několikrát PBS před přidáním montovacího média k řezům a opatrně přiklopte krycím sklíčkem přes horní část.

Jemně sklopte krycí sklíčko, abyste zabránili vzniku vzduchových bublin. Zvláštní pozornost věnujte zmraženým řezům, snažte se je nestlačovat nebo příliš silně netlačit na krycí sklíčko, protože to může narušit jejich tkáň.

Často je užitečné obarvit jádra, např. pomocí DAPI, který lze přidat do promývacího kroku nebo do montovacího média.

Je možné použít primární protilátky přímo konjugované s fluorescenčními značkami. To šetří čas a snižuje falešný signál, úroveň signálu však bude nižší. Existují metody amplifikace signálů nízké úrovně, včetně avidin-biotinového komplexu (ABC) a značené streptavidin-biotinové metody (LSAB).

10. Navrhované výchozí body pro optimalizaci

Nenechte se zastrašit mnoha aspekty protokolu IHC, které by mohly vyžadovat optimalizaci. Zde je seznam prvních kroků, které byste měli zvážit při optimalizaci v prvních fázích experimentů IHC:

Zpřístupnění antigenu pro řezy FFPE

Ředění primárních protilátek

Blokovací roztok

 

(Zdroj originálního textu: Proteintech. Redakčně upraveno.)

 

Literatura

1. Daneshtalab N, Doré JJ and Smeda JS, Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies., J Pharmacol Toxicol Methods., 2010;61(2):127-35.

2. Shi SR, Liu C, Pootrakul L et al., Evaluation of the value of frozen tissue section used as “gold standard” for immunohistochemistry., Am J Clin Pathol., 2008;129(3):358-66.

3. Fox CH, Johnson FB, Whiting J et al., Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem., 1985;33:845–853.

4. Yamashita S et al., Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Prog Histochem Cytochem., 2007;41:141-200.

5. Shi SR, Cote RJ and Taylor CR, Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J Histochem Cytochem., 1997;45(3):327-43.

6. Saper CB and Sawchenko PE, Magic peptides, magic antibodies: guidelines for appropriate controls for immunohistochemistry. J Comp Neurol., 2003;465:161–163.

Nejlepší tipy pro zamrazování a rozmrazování buněk pro udržení jejich životaschopnosti

Nejlepší tipy pro zamrazování a rozmrazování buněk pro udržení jejich životaschopnosti

Kryokonzervace je zavedená laboratorní technika používaná k uchovávání buněk a jiného biologického materiálu při teplotě blízké teplotě kapalného dusíku (-196°C). Tento článek pojednává o osvědčených postupech pro zamrazování a rozmrazování buněk, aby byla udržena jejich vysoká životaschopnost.

více informací
Rychlokurz epigenetiky – 2. část

Rychlokurz epigenetiky – 2. část

V tomto druhém příspěvku na téma epigenetiky se budeme zabývat metodami, které se používají ke studiu metylace DNA a RNA.

více informací
Rychlokurz epigenetiky – 1. část

Rychlokurz epigenetiky – 1. část

Zatímco obor genetiky se zabývá studiem genů a tím, jak mohou změny v sekvenci genomu vést ke vzniku dědičných a ireverzibilních fenotypů, epigenetika řeší, jakým způsobem dochází ke změnám fenotypu řízenou aktivací či deaktivací genů beze změny základního kódu. V tomto příspěvku popíšeme, co je epigenetika, a také vám nabídneme přehled různých typů možných epigenetických modifikací.

více informací