Optimalizace promývacího kroku na 96-jamkových mikrotitračních destičkách pro testy ELISA

kategorie: imunologie
vytvořeno: 1.2.2021

Autoři článku: Judy Gibbs, Michelle Vessels, Mark Rothenberg, Ph.D.

Úvod

Bez ohledu na to, zda je na povrch vázán antigen nebo protilátka, vyžadují testy ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assays) krok fyzické separace k oddělení volného analytu od vázaného. Tento krok se obvykle označuje jako „promývací“. U mikrotitračních destiček se promývání provádí postupným plněním jamek promývacím roztokem a následným vyprázdněním buď dekantováním nebo aspirací.

Pro maximální přesnost a citlivost testu je nutné úplné oddělení volných frakcí od vázaných. Ukázalo se, že krok promývání může být hlavním ovlivňujícím faktorem přesnosti testu. Pro získání konzistentních a spolehlivých výsledků je tedy optimalizace tohoto kroku zásadní. Podívejte se na některé z aspektů promývacího kroku, které by měly být optimalizovány:

Složení promývacího roztoku

Způsob dávkování používaný k plnění jamek promývacím roztokem

Podmínky aspirace kapaliny, včetně síly vakua

Použitím dobře udržované automatizované promývačky mikrotitračních destiček lze snadno zajistit přesné a spolehlivé promytí při každém testu.

Složení promývacího roztoku

Promývací roztok by měl obsahovat fyziologický pufr (přátelský k enzymům), jako je fyziologický roztok pufrovaný fosfáty (PBS), Tris-pufrovaný fyziologický roztok (TBS) nebo fyziologický roztok pufrovaný imidazolem. Dobré výsledky vykazuje použití fyziologického roztoku s imidazolem, který je kompatibilní se všemi enzymy, které jsou typicky používány pro enzymové imunotesty.

Při použití alkalické fosfatázy nelze kvůli účinku fosfátů na aktivitu enzymu zároveň použít fosfátové pufry. Anorganický fosfát může působit jako pseudosubstrát pro alkalickou fosfatázu a účinně snižovat její specifickou aktivitu se substrátem. Při použití peroxidázy se do promývacího roztoku nesmí přidávat azid sodný, který inhibuje aktivitu peroxidázy. Voda je nevhodný promývací pufr kvůli proměnlivému pH a nedostatečné schopnosti pufrovat proteiny (proteiny vázané na povrch je třeba chránit před denaturací).

Vhodné je přidání detergentu, jako např. Tween 20. Detergenty pomáhají odstranit volně vázané proteiny a působí jako hydrofobní blokovací činidlo, které blokuje ta místa na povrchu, která byla uvolněná desorpcí bílkovin během promývání. Doporučená koncentrace je 0,01 % až 0,03 %. Cílem je odstranit volně vázané proteiny bez ztráty specificky vázaných proteinů nebo inaktivace enzymů, což může nastat při příliš vysoké koncentraci detergentu, kdy je překročena hodnota kritická koncentrace pro vznik micel (CMC).

Vliv síly toku na imobilizované biomolekuly

Aby bylo dosaženo přesného promývání, do každé jamky mikrotitrační destičky by měl být promývací roztok dávkován stejnou silou a ve stejném objemu. Ideální je tedy pozvolné přidání promývacího roztoku automatickou promývačkou. Mírný tok tekutiny do jamky odstraňuje volný protein, aniž by odstranil vázaný protein. Pokud je tok promývacího roztoku příliš intenzivní, může být jeho silou odstraněn protein a snížena aktivita enzymu. Příklad příliš intenzivního a nekonzistentního přidávání promývacího roztoku je použití střičky. Sílu toku u jednotlivých jamek nelze kontrolovat a je obvykle příliš velká, takže neumožňuje přesné promývání.

Objem promývacího roztoku dávkovaného na jamku by měl být takový, aby pokryl celou plochu potaženou antigenem nebo protilátkou. Doporučujeme vyplnit celou jamku (přibližně 300 µL na jamku pro 96-jamkovou mikrotitrační destičku).

Pokud je pozadí vyšší než je žádoucí, bývá často lákavé intenzitu toku při dávkování promývacího pufru zvýšit ve snaze odstranit nenavázaný protein, který by mohl způsobovat vyšší hodnoty, než je očekáváno. To se však nedoporučuje z výše uvedených důvodů. Místo zvýšení síly toku do jamek je lepší zvýšit počet promývacích cyklů, a tím eliminovat problémy pozadí způsobené zbytkovým nenavázaným proteinem v jamkách.

Optimální počet promývacích cyklů lze určit experimentálně, nicméně naše výsledky ukazují, že při méně než třech promývacích cyklech zůstává v jamkách zbytkový nenavázaný protein, a více než pět cyklů vede k nežádoucí desorpci proteinů. Protože je promývání vlastně proces ředění (část původního roztoku zůstává po každé aspiraci jako film tekutiny na povrchu), cílem je původní roztok zředit co nejvíce, aniž by došlo k odstranění vázaného proteinu. (Poznámka: úplná aspirace je nežádoucí, protože vysušení povrchově vázaného proteinu vede k jeho denaturaci.) Toto optimální ředící schéma nastává mezi 3 a 5 cykly. Přidání pětiminutového kroku odmáčení (soak step) po posledním promytí se velmi osvědčilo pro odstranění zbývajícího nenavázaného proteinu, který může být zachycen v rozích jamky.

Optimalizace aspirace

K většině problémů s přesností spojených s promýváním dochází během odsávání. Přestože je nejlepším způsobem odstraňování kapaliny z jamek (ve vztahu k Variačnímu koeficientu; CV) ruční dekantace, aspiraci lze použít – je-li optimalizována – ke snížení nepříznivých účinků na povrchově vázaný protein. Optimalizaci pak vyžadují (i) poloha jehly, (ii) směr odsávání (shora dolů) a (iii) síla vakua.

U jamek s plochým dnem by měly být odsávací jehly umístěny ve střední pozici, tedy mezi středem a okrajem jamky. (Střed jamky by měl být obsazen dávkovacími jehlami.) Jehly by měly být vzdáleny od dna jamek tak, aby se nedotýkaly jejich povrchu. Ideálně by neměl povrch během promývání nikdy úplně vyschnout, poloha jehly by měla zajišťovat ponechání malého množství tekutiny v jamce až do konce aspirace. Tento malý objem kapaliny se hromadí na okraji jamky působením gravitační síly na film zbytkové kapaliny na bočních stěnách. Na konci promývání lze tento malý objem ručně dekantovat poklepáním desky vzhůru nohama na savou papírovou utěrku. Je důležité tuto zbytkovou kapalinu odstranit před přidáním substrátu, protože promývací roztoky obsahující detergenty mohou velmi výrazně potlačit vznik (kolorimetrického, fluorometrického nebo luminometrického) produktu. To následně způsobuje nepřesnosti ve výsledcích, pokud není objem zbytkové kapaliny v jednotlivých jamkách konzistentní.

Nejlepší automatizované promývačky destiček jsou nastaveny na odsávání shora dolů: jehly začnou odsávat jakmile jsou ponořeny do kapaliny, takže aspirace probíhá, zatímco jehly sestupují na dno jamky. Tento typ aspirace snižuje smykové působení a zabraňuje vzduchovým proudům vysušit povrchově vázaný protein. Je naprosto zásadní, aby jehly přestaly nasávat, jakmile je kapalina odstraněna, jinak budou nasávat vzduch a zbytečně tak vysušovat povrch potažený proteinem. Shora dolů pracující odsávačky tento problém z větší části řeší, protože jehly aspirují při pohybu dolů ke dnu jamky a zastaví, když dna dosáhnou. Jehly nastavené do nejnižší polohy před začátkem odsávání aspirují po určitou dobu (dostatečnou k aspiraci přibližného objemu celé jamky) bez ohledu na skutečné množství kapaliny v jamce. To může mít za následek „suchou aspiraci“ se zbytečným sušením poté, co je kapalina odstraněna.

Vyschnutí povrchu je při testech zásadní problém. Dokonce i minimální vysušení může mít za následek ztrátu aktivity proteinu, zejména pak enzymové aktivity. Tabulka 1 ukazuje účinek sušení na enzymatickou aktivitu po 20 minutách od aspirace po posledním promytí před přidáním substrátu. Očekávaná hodnota optické hustoty (OD) je pro tento test při správném provedení 1,200. Z tabulky je patrné, že je po 20 minutách bez tekutiny v jamkách vývoj barvy výrazně potlačen. Jamky na okrajích destičky jsou ovlivněny více než vnitřní jamky, jak ukazují jejich nižší OD. (Jamky označené jako „0“ jsou v rozmezí do 10 % od průměrného OD pro celou destičku. Pouze jamky, které leží mimo tento 10% rozsah, se zobrazují jako vysoké nebo nízké jamky).

Optimalizace síly vakua je zásadní pro udržení nízké hodnoty CV během testu. Pokud je síla vakua (měřeno v mmHg nebo PSI) příliš vysoká, smykové síly a proudy vzduchu budou denaturovat vázaný protein a inaktivovat enzymy. Pokud je síla vakua příliš malá, v jamkách zůstane nadměrné množství zbytkového promývacího roztoku, což potlačí enzymatickou aktivitu. Každý tvar jamky (plochý nebo kulatý) a typ destičky (plná destička, stripová destička, destičky různých výrobců) má vlastní optimální sílu vakua. Zjistili jsme však, že 400 mmHg je optimální pro většinu typů (výsledky viz tabulka 2).

Tabulka 1. Efekt vysušení při 20 minutovém prodlení

Tabulka 2. Vliv síly vakua při aspiraci na přesnost testu

Závěr

Pro přesnost stanovení je rozhodující optimalizace separačního kroku. Prakticky všechny nenavázané proteiny musí být odstraněny pro dosažení maximální citlivosti, specifičnosti a přesnosti. Co se může jevit jako jednoduchý úkon s mikrotitračními destičkami, kde není co zkazit – promývání, je ve skutečnosti tím krokem testu, který může způsobit nejnepříjemnější problémy s přesností. Je nutné nastavit rovnováhu mezi ponecháním příliš velkého množství nenavázaného proteinu na straně jedné a odstraněním nebo denaturací specificky vázaného proteinu na straně druhé. Této rovnováhy lze dosáhnout dodržováním následujících doporučení:

  Promývací roztok by měl být fyziologický pufr, který nebude interferovat s imunologickou nebo enzymatickou aktivitou a měl by obsahovat v nízké koncentraci detergent pro snadnější odstranění nenavázaného proteinu.

Do každé jamky je třeba dávkovat stejný objem promývacího roztoku stejnou (mírnou) silou, aby nedošlo k odstranění navázaného proteinu.

Pro dosažení nejlepších výsledků by měly být jamky promyty minimálně třikrát a maximálně pětkrát. Přidání pětiminutového odmáčení (soak step) po závěrečném promývacím cyklu usnadní odstranění nenavázaného proteinu zachyceného v rozích jamek.

Odsávání by mělo být řízeno tak, aby povrch jamky nevyschl. Optimalizace síly vakua je zásadní pro dobrou přesnost analýzy.

A konečně, povrch jamky by měl být udržován neustále vlhký. Při testech na více destičkách je třeba udržovat jamky naplněné promývacím roztokem až do pokračování v dalším kroku testu, nebo nechat destičky otočené jamkami dolů na mokré papírové utěrce, aby byl povrch hydratovaný během doby, kdy se s destičkou nepracuje.

Toto jsou základní pravidla při optimalizaci kroku separace ELISA testu.

Reference

1. Bjerrum, O.J. and Heegaard, N.H.H. Handbook of Immunoblotting of Proteins, Volume 1. Boca Raton, Florida: CRC Press, Inc. 1988.
2. Craig, J.C., et al. Journal of Biological Standardization. 17; 1989; 125-135.
3. Engvall, E. & Perlmann, P. Immunochemistry. 1971; 8:871.
4. Gardas, A. & Lewartowska, A. Journal of Immunological Methods. 1988; 106:251-255.
5. Graves, H.C.B. Journal of Immunological Methods. 1988; 111:157-166.
6. Kenny, G.E. and Dunsmoor, C.L. Israel. Journal of Medical Sciences. 1987; 23:732-734.
7. Maggio, E.T. Enzyme Immunoassay. Boca Raton, Florida: CRC Press, Inc. 1980.
8. Stenberg, M. & Nygren, H. Journal of Immunological Methods. 1988; 113:3-15.
9. Vogt, R.F., et al. Journal of Immunological Methods. 1987; 101:43-50.

 

(Převzato ze zahraničního zdroje, redakčně upraveno.)

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací