Metody optického kontrastu

Autor článku: Wymke Ockenga

Metody optického kontrastu

Fyzikální vlastnosti a oblasti použití

Metody optického kontrastu poskytují možnost snadno zkoumat živé a bezbarvé vzorky pomocí biologického mikroskopu. Různé mikroskopické techniky mají za cíl změnit fázové posuny způsobené interakcí světla se vzorkem na amplitudové posuny, které jsou pro lidské oko viditelné jako rozdíly v jasu.

Vizualizace živých vzorků je výzva

Obr.1 :Amplitudové objekty a fázové objekty.

Horní řada: Když světlo prochází takzvaným objektem amplitudy (červený rámeček), amplitudy (A) světelných vln se snižují (ΛA). Lidské oko to detekuje jako ztrátu jasu.

Střední řada: U takzvaných fázových objektů vede průchod světla objektem k fázovému posunu vlny (Λϕ), který lidské oko nedokáže detekovat.

Dolní řada: Nezměněná světelná vlna.

Světelná mikroskopie často poskytuje pouze slabý obraz nepoškozených vzorků, ve kterém je detekovatelných pouze několik detailů. Chcete-li na obrázku vidět více podrobností, je důležitý silnější kontrast. Jedním ze způsobů, jak kontrast zvýšit, je obarvení vzorku. Toto však není pro živé organismy možné, a tak zůstávají nezabarvené a nenápadné. Také tyto vzorky ve skutečnosti interagují s dopadajícím světlem v optickém mikroskopu, ovšem dochází zde k fázovému posunu, který není lidským okem detekovatelný. Oko může zaznamenat pouze změny amplitudy (jasu) a frekvence (barvy).

Kontrast nám dává možnost rozlišovat mezi vzorkem a pozadím a také možnost zobrazit detaily ve vzorku. Je definován jako rozdíl v intenzitě světla mezi obrazem a sousedním pozadím ve srovnání s celkovou intenzitou pozadí. Aby byly tyto rozdíly patrné lidským okem, musí činit nejméně dvě procenta. Pomocí fotodetektorů lze dosáhnout velkých vylepšení.

Kontrast však neurčuje pouze vzorek a jeho interakce se samotným světlem. Kritický je také optický systém, který se používá k pozorování vzorku a jeho schopnost zaznamenávat obrazové informace. V mikroskopickém systému závisí kontrast na nastavení správné clony, stupni optické aberace, použité metodě kontrastu, vzorku a detektoru.

Kontrast obrazu získaného optickým mikroskopem lze ovlivnit nezávisle na kontrastních metodách změnou nastavení clony. Ale pokud je například kondenzátor zastaven příliš daleko, rozlišení bude narušeno a mohou se objevit difrakční artefakty.

Nejstarší metodou dosažení adekvátního kontrastu je pravděpodobně obarvení vzorku. Obvykle je však možné pouze u mrtvého materiálu a někdy si vyžaduje složité protokoly barvení. Pokud někdo chce pozorovat živé buňky, barvení není snadné. Proto si různé techniky – poskytované adekvátním optickým mikroskopem – kladou za cíl změnit fázový posun, který je způsoben interakcí světla se vzorkem, na amplitudový posun.

Fázový kontrast a rozdílový interferenční kontrast (DIC) jsou příklady těchto kontrastních metod. Jiné metody optického kontrastu jsou tmavé pole a polarizační kontrast.

Obr 2a: Chuťové pohárky králíka – mikroskop s fázovým kontrastem.

Obr 2b: Kontrastní mikroskop s diferenciální interferencí.

Obr. 2c: Světelný mikroskop.

Interakce mezi světlem a vzorkem

Pokud dopadající světlo zasáhne vzorek, budou spolu interagovat. Možnými důsledky jsou absorpce, odraz, difrakce, rozptyl světla a lom světla. Během tohoto procesu se mění dopadající světelné vlny. Možné jsou fázové posuny i změny amplitudy.

V tomto ohledu lze rozlišovat mezi fázovými a amplitudovými objekty. V ideálním případě jsou fázové objekty vzorky, které mění fázi, ale nikoli amplitudu světelné vlny. Naproti tomu objekty amplitudy ovlivňují pouze amplitudu, ale nikoli fázi světla. Ploché a neobarvené buňky téměř dosahují charakteristik fázového objektu pro viditelné světlo. Protože ale vedou pouze k fázovému posunu, který lidské oko nevidí, je jejich kontrast v mikroskopii ve světlém poli velmi nízký. Samotné objekty amplitudy lze velmi dobře zobrazit v mikroskopii ve světlém poli. Snižují amplitudu a tím i intenzitu procházejícího světla.

Obarvené nebo přirozeně zbarvené objekty lze velmi dobře zobrazit ve světlém poli. Patří k amplitudovým objektům. Snižují procházející světlo a následně snižují amplitudu na začátku vlny. Ale nejsou to ideální objekty amplitudy. Kromě amplitudy ovlivňují také složení dopadajícího světla. Pohlcují nebo odrážejí vlny s odlišnou frekvencí, zatímco světlo jiných vlnových délek může nerušeně procházet.

K fázovým posunům dochází z důvodu různých indexů lomu vzorku a okolního média. Pokud světelná vlna vstoupí do buňky, bude nepatrně zpomalena, zatímco amplituda zůstane stejná. Když světlo opouští buňku, obnovuje rychlost a prochází médiem se stejnou frekvencí, vlnovou délkou a amplitudou jako dříve. Přesto se ve srovnání se světlem, které pouze prošlo středem, jeho fáze posunula.

Vzhledem k tomu, že lidské oko a další optické detektory nejsou schopny rozpoznat a detekovat fázové posuny světelných vln, je hlavním cílem kontrastních metod v případě neobarvených vzorků generování kontrastu amplitudy a změna fázového kontrastu na kontrast amplitudy.

Velký dopad na biologický výzkum

Použití neobarvených vzorků nabízí mnoho výhod ve srovnání s použitím fixovaných a obarvených vzorků. Umožňuje pozorování živých objektů v biologickém mikroskopu, které postrádají fixační a barvící artefakty. Fixace a zabarvení může například způsobit zmenšení nebo zvětšení objemu vzorku. Kromě toho existuje riziko zničení odlišných struktur v buňce nebo podstatné změny jejich morfologie. Jediným jistým způsobem, jak toto nebezpečí eliminovat, je použití živých vzorků, které neobsahují artefakty a poskytují spolehlivé a autentické informace.

Další velkou výhodou mikroskopie živých buněk je zkoumání časově závislých scénářů. Kromě získávání statických informací o buňce a snímku její situace lze snadno sledovat celé procesy, např. pohyblivost buněk, dělení buněk a také apoptózu. Protože tyto procesy mohou příležitostně trvat hodně času, může být vhodné přidat do systému optického mikroskopu kameru pro záznam časosběrných filmů.

Informace a dojmy získané různými metodami optického kontrastu se liší v závislosti na jejich původu. Pro získání co nejpřesnějšího a nejpodrobnějšího obrazu zkoumaného vzorku je proto vhodné spoléhat se na kombinaci různých kontrastních technik. Zatímco světlé pole často neumožňuje přesné pozorování morfologie buňky, další metody optického kontrastu mohou poskytnout další poznatky.

Více informací lze získat přidáním fluorescenčních markerů k živému obrazu buněk. Požadovaný protein v buňce může být označen fluorescenčním proteinem, jako je GFP. Jeho lokalizaci lze poté vysledovat a přesně určit uvnitř buňky pomocí světelných mikroskopických obrazů. Existuje také možnost spojit GFP se signálem o umístění peptidu. Tímto způsobem lze vizualizovat odlišné kompartmenty, jako je např. endoplazmatické retikulum.

Moderní optické mikroskopy používané ve výzkumu mají obvykle modulární konstrukci, která umožňuje rychlé přepínání mezi jednotlivými kontrastními metodami nebo dokonce jejich současnou aplikaci. Metody optického kontrastu poskytují příležitost snadno zkoumat živé a bezbarvé vzorky v každodenní laboratorní praxi.

 

(Převzato ze zahraničního zdroje, redakčně upraveno.)

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací