V hlavní roli specifita ELISA kitů

kategorie: imunologie
vytvořeno: 15.2.2018

Souhrn

Dva nové glukagonové testy společnosti Mercodia poskytují vysoce kvalitní řešení tím, že nabízejí vynikající specifičnost, optimální citlivost a nízké požadavky na objem vzorku. Tyto testy jsou snadno použitelné, nevyžadují žádné namáhavé a časově náročné čištění nebo předběžné ošetření a nezahrnují použití radioaktivity. Mohou být využity v základních, preklinických a klinických studiích.

V hlavní roli přesnost

Glukagon je, díky své schopnosti stimulovat tvorbu glukózy v játrech, základním regulátorem glykemické regulace. Řada studií prokázala, že při všech formách diabetu dochází k dysregulaci glukagonu. Zájem o tento hormon v posledních letech výrazně vzrostl a s pokroky v oblasti vývoje léků je potřeba řešit i dlouhodobé analytické překážky jeho stanovení. Glukagon je peptidový hormon, který je zpracováván z mnohem většího prekurzoru proglukanonu.[1] Exprese a aktivita prohormonu konvertázy 2 (PC2/PCSK2) v pankreatických alfa buňkách vede ke vzniku 29 aminokyselinového polypeptidu glukagonu. Glukagon může být částečně degradován endopeptidázou, což vede ke zkrácené formě známé jako glukagon 19-29 nebo miniglukagon. Miniglukagon je přítomen v ostrůvcích a cílových tkáních glukagonu ve velmi nízkých koncentracích, ale jak se zdá, je vysoce účinným regulátorem fyziologických procesů v těchto tkáních. Bylo také zjištěno, že má opačné účinky než glukagon.[2, 3, 4] Štěpení PC2 není jediným způsobem jakým je proglukagon zpracováván. Prokonvertázový enzym PC1/3 (PCSK1/3), štěpí proglukagon na řadů proteinů, včetně glycininu, oxyntomodulinu, GLP-1 a GLP-2 (obr. níže).

 

Při stanovování glukagonu je tedy nutné vzít v úvahu posttranslační zpracování proglukagonu. Konečné produkty nejsou všechny výrazně odlišné proteiny se zcela jedinečnými sekvencemi. Řada proteinů obsahuje úplnou sekvenci glukagonu, například proglukagon. Kompletní aminokyselinová sekvence glukagonu tvoří také velkou část glycitinu a oxyntomodulinu. Zatímco biologický účinek glukagonu může být jedinečný, jeho sekvence nejsou, což doposud vedlo k chybám při stanovení, jelikož protilátky používané v glukagonových testech mohou rozpoznat epitopy sdílené výše uvedenými hormony.

V úvahu by měli být brány i cirkulující hladiny homologních proteinů, které mohou v testu na glukagon vyvolat zvlášť problematickou reakci, zejména glycitin. Proglukagon 1-61 představuje pouze zanedbatelnou frakci imunoreaktivního glukagonu, i když vzorky pacientů s pankreatektomií nebo pacientů s renálním selháním mohou obsahovat zvýšené hladiny.[5]

 

Oxyntomodulin cirkuluje na detekovatelných, ale nízkých hladinách.[6] Glycintin cirkuluje na mnohem vyšších hladinách než glukagon, jak bylo prokázáno použitím nových glukagonových a glycitinových specifických stanovení (Obr. 3). Tyto hodnoty jsou regulovány odlišně, což znamená, že „odkrývání“ nebo odečítání pozadí nemusí vést k opravě hodnot testu na glukagon. Nepřesné měření glukagonu může mít obrovské negativní dopady na výzkum a klinická rozhodnutí. (obr. 4)

 

 

Dynamické změny jak inzulínu, tak glukagonu jsou zásadní pro vývoj diabetu, a proto je stanovení poměru inzulín: glukagon používáno po mnoho let ve výzkumu jako ucelenější metabolický index měření samotného inzulínu.[8, 9,10, 11, 12] Mimo to, poskytuje tento poměr pohled na skladování a využití živin v normálních i katabolických stavech, jako je infekce, trauma, rakovina atd.[8] Skutečný poměr inzulín:glukagon nelze stanovit pokud používáte testy (pro každý biomarker), které nejsou příliš specifické.

Pro specifické stanovení lze využít skutečnosti, že proglukagon 1-61, oxyntomodulin a glicentin obsahují plnou glukagonovou sekvenci a prodloužení na N-konci a/nebo C-konci (obr. 1 a 2). Mercodia řeší tento problém tak, že v jejích testech jsou dvě protilátky, zaměřené na oba konce glukagonu. Tato strategie byla také zvolena s ohledem na přítomnost kratších forem glukagonu – miniglukagon, nebo glukagon 3-29 a 5-29, které jsou produkovány sekvenční degradací (a inaktivací) dipeptidyl peptidázou IV (DPPIV).[13, 14]

 

Použité vysoce specifické myší monoklonální protilátky, jsou extenzivně charakterizovány metodami ELISA a Biacore. Tyto dvě protilátky se používají v obou Mercodia ELISA testech na glukagon a zkoušky zkřížené reaktivity odhalily vynikající profil specifity (Obr. 6).

 

 

Není důležité pouze zkoumání zvýšení hladiny glukagonu, ale stejně důležité je schopnost detekce následného snížení hladiny glukagonu. Glukagon cirkuluje v nízkých koncentracích kolem 10 pmol/l (35 pg/ml) nebo méně a může se během hypoglykemických stavů zvýšit na ~ 20-30 pmol/l (70 až 105 pg/ml) a může klesnout na 1-2 pmol/l (3,48 – 7 pg/ml) během hyperglykémie.[16,17] Komerčně dostupné testy neposkytují dostatečnou senzitivitu pro detekci glukagonu za různých fyziologických podmínek. Nejcitlivější testy měli citlivost přibližně 10 pmol/l (35 pg/ml), ale výsledky kolem této koncentrace nebyly spolehlivé. Podle autorů studie porovnávající testy na glukagon, tak testy s citlivostí >5 pmol/l jsou nevhodné pro kompletní charakterizaci sekrece glukagonu. Kromě toho měli některé testy špatné zotavení v plazmě a/nebo pufru, u testů se uváděly variabilní výchozí koncentrace a glukagon nebyl vždy zjištěn, zvláště za podmínek kdy byl potlačován.[7]

Testy Mercodia na glukagon pro lidské (10-1271-01) a zvířecí vzorky (10-1281-01) mají citlivost 1,5 pmol/l (5 pg/ml) a 2 pmol/l (7 pg/ml). Citlivost těchto testů spolu se širokým dynamických rozsahem umožňuje vědcům měřit fyziologicky relevantní koncentrace glukagonu v různých experimentálních paradigmatech.

Překonání omezení objemu vzorku

Požadavky na objem vzorku také významně omezily použití testů na glukagon. Většina komerčně dostupných metod vyžaduje alespoň 50-100 μl plazmy.To má přímé důsledky na množství analyzovaných látek, které lze měřit, počet časových bodů, které lze zkoumat, a tedy na rozsah závěrů.

Mercodia ELISA testy na glukagon vyžadují u lidských vzorků pouze 25 μl vzorku a u zvířecích vzorků 10 μl, čímž poskytují značnou výhodu a umožňují vědcům měřit glukagon v různých experimentálních modelech.

Důsledky pro výzkum translace

Pro porozumění fyziologickým a patofyziologický procesům, jakož i pro vývoj terapeutických strategií je důležitý přístup typu „bench-to-bedside“. Dva ELISA testy společnosti Mercodia poskytují analytická řešení pro studie, které pokrývají spektrum translačního výzkumu založené na rozsáhlé práci, která byla provedena za účelem charakterizace toho, jak tyto metody fungují s různými typy vzorků. Glukagonová sekvence je v rámci druhů vysoce konzervativní (Obr. 7), ale validace různých typů vzorků je zásadní, protože sekvenční homologie není jediným faktorem, který ovlivňuje vazbu protilátka-antigen v imunotestu. Například matricové interference (běžné ve vzorcích zvířat) mohou vést k falešně zvýšeným nebo falešně nízkým koncentracím. Testy Mercodia obsahují unikátní blokovací roztok, který zabraňuje nebo minimalizuje matricové interference, zvláště důležité pro test na glukagon u zvířat.

10 μl Mercodia Glukagon ELISA byl validován pomocí vzorků myší, krys, prasat a primátů (údaje jsou k dispozici v návodu k použití), což je vynikající volbou pro různé malé i velké preklinické studie na zvířatech. Oba testy na glukagon mohou být použity se vzorky z kultivovaných buněk, poskytující přesné možnosti měření glukagonu pro osoby provádějící výzkum in vitro. (např. konverze alfa na beta buňky a naopak, lidské embryonální kmenové buňky na alfa nebo beta buňky, produkce clusterů podobných ostrůvkům).

Kromě již zmíněné studie různých testů na glukagon[7], byl test Mercodia zahrnut do další studie tří nových dostupných testů na glukagon, jejímž závěrem bylo, že test Mercodia má nejlepší výsledky, pokud jde o specifičnost, přesnost a citlivost. Výsledky testů jsou reprodukovatelné a test byl označen jako vhodný pro měření koncentrace glukagonu.

Citace

1. Sandoval DA and D’Alessio DA (2015) Physiology of Proglu¬cagon Peptides: Role of Glucagon and GLP-1 in Health and Di¬sease. Physiol Rev 95:513-548.

2. Dalle S et al. (1998) Miniglucagon: A Local Regulator of Islet Physiology. Ann N Y Acad Sci 865:132-140.

3. Dalle S et al. (1999) Miniglucagon (Glucagon 19-29), A Potent and Efficient Inhibitor of Secretagogue-Induced Insulin Release Through a Ca2+ Pathway. J Biol Chem 274:10869-10876.

4. Dalle S et al. (2002) Miniglucagon (Glucagon 19-29): A Novel Regulator of the Pancreatic Islet Physiology. Diabetes 51:406- 412.

5. Holst JJ (2010) Glucagon and Glucagon-Like Peptides 1 and 2. Results Probl Cell Differ 50:121-135.

6. Pocai A (2012) Unraveling Oxyntomodulin, GLP1’s Enigmatic Brother. J Endocrinol 215:335-346.

7. Bak MJ et al. (2014) Specificity and Sensitivity of Commercially Available Assays for Glucagon and Oxyntomodulin Measure¬ment in Humans. Eur J Endocrinol 170:529-538.

8. Unger RH (1971) Glucagon and the Insulin:Glucagon Ratio in Diabetes and Other Catabolic Illnesses. Diabetes 20:834-838.

9. Kuhl C and Holst JJ (1976) Plasma Glucagon and the Insulin:G¬lucagon Ratio in Gestational Diabetes. Diabetes 25:16-23.

10. Tiedgen M and Seitz HJ (1980) Dietary Control of Circadian Va¬riations in Serum Insulin, Glucagon and Hepatic Cyclic AMP. J Nutr 110:876-882.

11. Ferrannini E et al. (2014) Metabolic Response to Sodium-Gluco¬se Cotransporter 2 Inhibition in Type 2 Diabetic Patients. J Clin Invest 124:499-508.

12. Merovci A et al. (2014) Dapagliflozin Improves Muscle Insulin Sensitivity but Enhances Endogenous Glucose Production. J Clin Invest 124:509-514.

13. Hinke SA et al. (2000) Dipeptidyl Peptidase IV (DPIV/CD26) Degradation of Glucagon. Characterization of Glucagon De¬gradation Products and DPIV-Resistant Analogs. J Biol Chem 275:3827-3834.

14. Pospisilik JA et al. (2001) Metabolism of Glucagon by Dipeptidyl Peptidase IV (CD26). Regul Pept 96:133-141.

15. Howard JW et al. (2015) Identification of Plasma Protease Deri¬ved Metabolites of Glucagon and Their Formation Under Typical Laboratory Sample Handling Conditions. Rapid Commun Mass Spectrom 29:171-181.

16. Holst JJ (1983) Molecular Heterogeneity of Glucagon in Normal Subjects and in Patients with Glucagon-Producing Tumours. Di¬abetologia 24:359-365.

17. Christensen M et al. (2011) Glucose-Dependent Insulinotropic Polypeptide: A Bifunctional Glucose-Dependent Regulator of Glucagon and Insulin Secretion in Humans. Diabetes 60:3103- 3109.

18. Wewer Albrechtsen NJ et al. (2014) Hyperglucagonaemia Ana¬lysed by Glucagon Sandwich ELISA: Nonspecific Interference or Truly Elevated Levels? Diabetologia 57:1919-1926.

Prezentace produktů společnosti Akoya

Prezentace produktů společnosti Akoya

Srdečně Vás zveme na květnovou prezentaci produktů pro multiplexovou imunofluorescenci a prostorovou fenotypizaci buněk společnosti Akoya. Představení proběhne 10.5. v Praze a 11.5. v Brně.

více informací
100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

100 markerů na jednom řezu? – Ultrahiplex mIF od společnosti Akoya

Nejen těm, kteří se zajímají o fenotypizaci buněk, ale také těm, kteří se zabývají IHC a IF, přinášíme nové produkty a přístroje od společnosti Akoya.

více informací
Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Snížení autofluorescence tkáně a významné zvýšení podílu signálu k šumu – Vector Laboratories

Imunofluorescence (IF) je jednoduchá, nicméně účinná metoda k vizualizaci exprese proteinů v tkáních či buňkách pomocí protilátek konjugovaných s fluoroforem. Tato technika však vyžaduje optimalizaci a důkladné pochopení, abychom dosáhli rovnováhy mezi pěknou strukturou zabarvení a šumem pozadí. Není nic horšího, než když po potenciálně celodenním barvicím protokolu, jemuž předcházela obšírná preparace tkáně, experimentální příprava apod., nahlédnete do mikroskopu a v něm vidíte pouze šum pozadí či nespecifické zabarvení. Tento článek si klade za cíl být průvodcem při rozpoznání problému s autofluorescencí, představit některé její potenciální příčiny a poučit o technikách, jimiž lze autofluorescenci potlačit či eliminovat tak, abyste dosáhli krásného a vysoce kvalitního fluorescenčního barvení. (Tento článek může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb.)

více informací