Jak zvýšit účinnost Vaší RNA interference a neohrozit Vaše buňky?

vytvořeno: 11.2.2019

Jak zvýšit účinnost Vaší RNA interference a neohrozit Vaše buňky?

RNA interference je stále oblíbenou metodou genového inženýrství, která je určena k cílenému útlumu exprese studovaných genů. (1) Základním principem je štěpení dvouvláknové RNA na krátké nepřekrývající se úseky, které rozpoznávají homologní mRNA a indukují utlumení její exprese. Jako každá metoda i RNA interference sebou nese rizikové aspekty. Klíčovým bodem není jen výběr funkční siRNA, buněčných linií a metody transfekce. Důležitým faktorem je zde i kvalita a kvantita samotné siRNA. Z hlediska kvality mohou mít negativní vliv na průběh experimentu případné kontaminace rezidui po izolačních činidlech siRNA. Koncentrace siRNA se zde ukazuje jako neméně důležitý faktor. (2)

 

Méně siRNA = větší zacílení

Několik studií ukazuje, že siRNA není vždy specifická a může vykazovat řadu off-target efektů. Bylo ukázáno, že tyto nepříznivé účinky mohou být výrazně sníženy použitím nižší koncentrace siRNA. (3, 4) Z tohoto důvodu je INTERFERin® speciálně navržen tak, aby poskytoval vysokou účinnost tlumení exprese při nízké koncentraci siRNA. Dodání 1 nM specifické siRNA pomocí INTERFERin® vykazuje selektivní a vysoce účinné vylučování genové exprese, zatímco konkurent (L2K) potřebuje alespoň 10 nM siRNA k dosažení 50% účinnosti tlumení (obr. 1).

 

Proč je vhodné činidlo INTERFERin®?

  • méně siRNA, lepší zacílení
  • vhodné pro transfekci miRNA a jiných oligonukleotidů (pre-miRNA, mimická miRNA, antimiR…)
  • více než 90% tlumení genu v celé řadě buněk
  • tlumení pomocí již při 1 nM siRNA
  • vynikající viabilita buněk
  • jednoduchý standardní protokol
  • kompatibilní se sérem a antibiotiky

 

Obrázek 1: INTERFERin® vyžaduje pouze 1 nM siRNA pro účinné tlumení genu. 3LL buňky, které stabilně exprimují luciferázu, byly transfekovány anti-Luc siRNA za použití INTERFERin® nebo konkurenčního L2K podle doporučení výrobce. Exprese luciferázy byla měřena po 48 hodinách za použití obvyklého testu.  U kontrolní siRNA nebyla pozorována žádná inhibice.

 

Překvapivě se dosáhlo 50% tlumení při 10 pM siRNA (obr. 2).

 

Obrázek 2: INTERFERin® je vysoce účinný i při extrémně nízké koncentraci siRNA. Buňky A549-GL3Luc byly transfekovány v přítomnosti séra s klesajícími koncentracemi anti-Luc siRNA za použití INTERFERin®. Exprese luciferázy byla měřena po 48 hodinách za použití obvyklého testu. U kontrolní siRNA nebyla pozorována žádná inhibice. Transfekce 1 nM siRNA zaměřené na endogenní laminaci A/C s INTERFERin® se výrazně redukuje exprese laminového genu na takřka nedetekovatelnou úroveň (obr. 3).

 

Obrázek 3: Transfekce 1 nM siRNA s INTERFERin® vede k účinnému a specifickému tlumení genu. CasSki buňky byly transfekovány 1nM laminem A/C siRNA za použití INTERFERin®. Po 48 hodinách byla účinnost tlumení laminu stanovena imunofluorescenční mikroskopií.

 

Vhodné pro transfekci miRNA

Transfekce oligonukleotidů mikroRNA (miRNA) se stále častěji používá k analýze biologických účinků specifických miRNA na funkci buněk. INTERFERin® je řešením pro distribuci miRNA, mimics nebo pre-miRNA. INTERFERin® je nejnovější generace transfekčního činidla siRNA a miRNA, speciálně vyrobené pro vysokou účinnost v celé řadě buněk, což vede k vysokému genovému tlumení nebo stimulaci genové exprese. Některé miRNA jsou také známé, že indukují genovou expresi spojením s promotorem daného genu. Například podávání miR-373 zprostředkované INTERFERinem vede k 3-násobnému zvýšení exprese E-kadherinu (obr. 4).

 

Obrázek 4: Transfekce miR-373 s přídavkem INTERFERinu zvyšuje expresi E-kadherinu. Buňky PC-3 byly naočkovány do 6-jamkové destičky a transfekovány pomocí miR-373 (25 nM) s použitím 8 ul jamky INTERFERinu. Po 72 hodinové transfekci, byla stanovena hladina exprese E-kadherinové mRNA pomocí RT-qPCR. Test byl normalizován expresí genu HPRT-1.

 

Kationické složky INTERFERinu vyžadují velmi malé množství oligonukleotidů, což vede k jemnému procesu transfekce. Jednoduchý a robustní protokol zajišťuje reprodukovatelné výsledky. Oligonukleotidy, jako je miRNA, mohou být transfekovány malým množstvím interferinu, což vede k silnému genovému tlumení nebo stimulaci genové exprese. Účinek INTERFERinu zůstává přibližně stejný bez ohledu na koncentraci, je tedy ekonomicky výhodný. Například míra změny s použitím odlišného objemu INTERFERinu je vždy mezi 1,5 a 1,8 (obr. 5).

 

Obrázek 5: INTERFERin® je již účinný i ve velmi malých množstvích. Buňky PC-3 byly vysety do 6-jamkové destičky a transfekovány pomocí miR-373 (10 nM) s použitím 4, 6 nebo 8 ul INTERFERinu na jamku. Po 72 hodinové transfekci byla exprese E-kadherinu analyzována pomocí Western Blot. Test byl normalizován použitím exprese β-aktinu.  Kvantifikace byla provedena s využitím kontroly jako reference.

 

Počet publikací používajících INTERFERin pro miRNA a molekuly podobné miRNA se výrazně zvyšuje (obr. 6).

 

Obrázek 6: INTERFERin® se podílí na rostoucím počtu publikací o transfekci miRNA. Přes 90 % tlumení genu. Pro mnoho adherentních buněčných linií nebo primárních buněk je 1 nM siRNA dostatečná k získání více nez 90% genového tlumení. U suspenzních buněčných linií může být pomocí INTERFERinu dosaženo 80% tlumení použitím 5 nM si RNA (tabulka 1).

 

Tabulka 1: Úspěšně transfekované buněčné linie, tlumení pomocí INTERFERin®. Specifické podmínky pro různé buněčné linie jsou k dispozici transfekční databázi Polyplus.

 

Vynikající životaschopnost buněk

Pokud jde o životaschopnost buněk, INTERFERin® překonává jiná transfekční činidla. 48 hodin po transfekci s 1 nM siRNA se buňky transfekované s INTERFERinem ukazují zdravé, zatímco při použití činidla S vykazují toxicitu (obr. 7).

 

Obrázek 7: INTERFERIN® je extrémně jemný k buňkám, jak je ukázáno v tomto srovnání morfologie buněk po 48 hodinách po transfekci siRNA za použití INTERFERinu nebo konkurenčních činidel. Buňky A549-GL3Luc byly transfekovány v přítomnosti séra s 1 nM luciferázovou siRNA za použití INTERFERin nebo konkurenčních činidel S nebo H dle protokolu výrobce.

 

Jednoduchý standardní protokol

INTERFERin® je ready-to-use činidlo s jednoduchých protokolem. Počáteční koncentrace 1 nM siRNA zajišťuje u většiny typů buněk tlumení většiny genů (Obr. 8). INTERFERin® je kompatibilní jak se sérem, tak s antibiotiky, čímž se zabrání jakémukoli časově náročnému promývání a změnám v médiích; INTERFERin může být ponechán na buňkách bez nežádoucích účinků.

 

Obrázek 8: Protokol INTERFERinu

 

Produkt je dostupný v následujících variantách:

 

Kat.č.ProduktMnožstvíCena bez DPH
409-01INTERFERin – 0.1 ml transfection reagent1 x 0,1 ml1 870 Kčkoupit
409-10INTERFERin – 1 ml transfection reagent1 x 1 ml9 990 Kčkoupit
409-50INTERFERin – 5 x 1 ml transfection reagent5 x 1 ml36 900 Kčkoupit

 

 

 

Citace:

1. Kodíček, M., (2007) Biochemické pojmy výkladový slovník, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

2. Kontrová, K. et al., (2009) Chem. Listy 103, 302-309 (2009)

3. Birmingham, A. et al., (2006) Nature Methods, Vol.3, No3, 199-204

4. Caffrey, D. et al., (2011) PLoS One. 2011;6(7):e21503. Epub 2011 Jul 5.

 

 

 

Co byste měli zvážit při nákupu klinického mikroskopu

Co byste měli zvážit při nákupu klinického mikroskopu

Pokud uvažujete o zakoupení nového klinického mikroskopu, zde je několik tipů, které Vám mohou pomoci k výběru nejlepšího přístroje pro Vaše potřeby.

více informací
Výběr nejlepších protilátek: Nordic Biosite

Výběr nejlepších protilátek: Nordic Biosite

Nordic Biosite svoje protilátky testuje v NordiQC a pokud jejich výsledek není optimální, dále na nich pracuje. Navíc výrobce poskytuje vzorky, na kterých si můžete vyzkoušet, jak protilátky vypadají v praxi ve Vašich podmínkách.

více informací