Jak zvýšit účinnost Vaší RNA interference a neohrozit Vaše buňky?

vytvořeno: 11.2.2019

Jak zvýšit účinnost Vaší RNA interference a neohrozit Vaše buňky?

RNA interference je stále oblíbenou metodou genového inženýrství, která je určena k cílenému útlumu exprese studovaných genů. (1) Základním principem je štěpení dvouvláknové RNA na krátké nepřekrývající se úseky, které rozpoznávají homologní mRNA a indukují utlumení její exprese. Jako každá metoda i RNA interference sebou nese rizikové aspekty. Klíčovým bodem není jen výběr funkční siRNA, buněčných linií a metody transfekce. Důležitým faktorem je zde i kvalita a kvantita samotné siRNA. Z hlediska kvality mohou mít negativní vliv na průběh experimentu případné kontaminace rezidui po izolačních činidlech siRNA. Koncentrace siRNA se zde ukazuje jako neméně důležitý faktor. (2)

 

Méně siRNA = větší zacílení

Několik studií ukazuje, že siRNA není vždy specifická a může vykazovat řadu off-target efektů. Bylo ukázáno, že tyto nepříznivé účinky mohou být výrazně sníženy použitím nižší koncentrace siRNA. (3, 4) Z tohoto důvodu je INTERFERin® speciálně navržen tak, aby poskytoval vysokou účinnost tlumení exprese při nízké koncentraci siRNA. Dodání 1 nM specifické siRNA pomocí INTERFERin® vykazuje selektivní a vysoce účinné vylučování genové exprese, zatímco konkurent (L2K) potřebuje alespoň 10 nM siRNA k dosažení 50% účinnosti tlumení (obr. 1).

 

Proč je vhodné činidlo INTERFERin®?

  • méně siRNA, lepší zacílení
  • vhodné pro transfekci miRNA a jiných oligonukleotidů (pre-miRNA, mimická miRNA, antimiR…)
  • více než 90% tlumení genu v celé řadě buněk
  • tlumení pomocí již při 1 nM siRNA
  • vynikající viabilita buněk
  • jednoduchý standardní protokol
  • kompatibilní se sérem a antibiotiky

 

Obrázek 1: INTERFERin® vyžaduje pouze 1 nM siRNA pro účinné tlumení genu. 3LL buňky, které stabilně exprimují luciferázu, byly transfekovány anti-Luc siRNA za použití INTERFERin® nebo konkurenčního L2K podle doporučení výrobce. Exprese luciferázy byla měřena po 48 hodinách za použití obvyklého testu.  U kontrolní siRNA nebyla pozorována žádná inhibice.

 

Překvapivě se dosáhlo 50% tlumení při 10 pM siRNA (obr. 2).

 

Obrázek 2: INTERFERin® je vysoce účinný i při extrémně nízké koncentraci siRNA. Buňky A549-GL3Luc byly transfekovány v přítomnosti séra s klesajícími koncentracemi anti-Luc siRNA za použití INTERFERin®. Exprese luciferázy byla měřena po 48 hodinách za použití obvyklého testu. U kontrolní siRNA nebyla pozorována žádná inhibice. Transfekce 1 nM siRNA zaměřené na endogenní laminaci A/C s INTERFERin® se výrazně redukuje exprese laminového genu na takřka nedetekovatelnou úroveň (obr. 3).

 

Obrázek 3: Transfekce 1 nM siRNA s INTERFERin® vede k účinnému a specifickému tlumení genu. CasSki buňky byly transfekovány 1nM laminem A/C siRNA za použití INTERFERin®. Po 48 hodinách byla účinnost tlumení laminu stanovena imunofluorescenční mikroskopií.

 

Vhodné pro transfekci miRNA

Transfekce oligonukleotidů mikroRNA (miRNA) se stále častěji používá k analýze biologických účinků specifických miRNA na funkci buněk. INTERFERin® je řešením pro distribuci miRNA, mimics nebo pre-miRNA. INTERFERin® je nejnovější generace transfekčního činidla siRNA a miRNA, speciálně vyrobené pro vysokou účinnost v celé řadě buněk, což vede k vysokému genovému tlumení nebo stimulaci genové exprese. Některé miRNA jsou také známé, že indukují genovou expresi spojením s promotorem daného genu. Například podávání miR-373 zprostředkované INTERFERinem vede k 3-násobnému zvýšení exprese E-kadherinu (obr. 4).

 

Obrázek 4: Transfekce miR-373 s přídavkem INTERFERinu zvyšuje expresi E-kadherinu. Buňky PC-3 byly naočkovány do 6-jamkové destičky a transfekovány pomocí miR-373 (25 nM) s použitím 8 ul jamky INTERFERinu. Po 72 hodinové transfekci, byla stanovena hladina exprese E-kadherinové mRNA pomocí RT-qPCR. Test byl normalizován expresí genu HPRT-1.

 

Kationické složky INTERFERinu vyžadují velmi malé množství oligonukleotidů, což vede k jemnému procesu transfekce. Jednoduchý a robustní protokol zajišťuje reprodukovatelné výsledky. Oligonukleotidy, jako je miRNA, mohou být transfekovány malým množstvím interferinu, což vede k silnému genovému tlumení nebo stimulaci genové exprese. Účinek INTERFERinu zůstává přibližně stejný bez ohledu na koncentraci, je tedy ekonomicky výhodný. Například míra změny s použitím odlišného objemu INTERFERinu je vždy mezi 1,5 a 1,8 (obr. 5).

 

Obrázek 5: INTERFERin® je již účinný i ve velmi malých množstvích. Buňky PC-3 byly vysety do 6-jamkové destičky a transfekovány pomocí miR-373 (10 nM) s použitím 4, 6 nebo 8 ul INTERFERinu na jamku. Po 72 hodinové transfekci byla exprese E-kadherinu analyzována pomocí Western Blot. Test byl normalizován použitím exprese β-aktinu.  Kvantifikace byla provedena s využitím kontroly jako reference.

 

Počet publikací používajících INTERFERin pro miRNA a molekuly podobné miRNA se výrazně zvyšuje (obr. 6).

 

Obrázek 6: INTERFERin® se podílí na rostoucím počtu publikací o transfekci miRNA. Přes 90 % tlumení genu. Pro mnoho adherentních buněčných linií nebo primárních buněk je 1 nM siRNA dostatečná k získání více nez 90% genového tlumení. U suspenzních buněčných linií může být pomocí INTERFERinu dosaženo 80% tlumení použitím 5 nM si RNA (tabulka 1).

 

Tabulka 1: Úspěšně transfekované buněčné linie, tlumení pomocí INTERFERin®. Specifické podmínky pro různé buněčné linie jsou k dispozici transfekční databázi Polyplus.

 

Vynikající životaschopnost buněk

Pokud jde o životaschopnost buněk, INTERFERin® překonává jiná transfekční činidla. 48 hodin po transfekci s 1 nM siRNA se buňky transfekované s INTERFERinem ukazují zdravé, zatímco při použití činidla S vykazují toxicitu (obr. 7).

 

Obrázek 7: INTERFERIN® je extrémně jemný k buňkám, jak je ukázáno v tomto srovnání morfologie buněk po 48 hodinách po transfekci siRNA za použití INTERFERinu nebo konkurenčních činidel. Buňky A549-GL3Luc byly transfekovány v přítomnosti séra s 1 nM luciferázovou siRNA za použití INTERFERin nebo konkurenčních činidel S nebo H dle protokolu výrobce.

 

Jednoduchý standardní protokol

INTERFERin® je ready-to-use činidlo s jednoduchých protokolem. Počáteční koncentrace 1 nM siRNA zajišťuje u většiny typů buněk tlumení většiny genů (Obr. 8). INTERFERin® je kompatibilní jak se sérem, tak s antibiotiky, čímž se zabrání jakémukoli časově náročnému promývání a změnám v médiích; INTERFERin může být ponechán na buňkách bez nežádoucích účinků.

 

Obrázek 8: Protokol INTERFERinu

 

Produkt je dostupný v následujících variantách:

 

Kat.č.ProduktMnožstvíCena bez DPH
409-01INTERFERin – 0.1 ml transfection reagent1 x 0,1 ml1 870 Kčkoupit
409-10INTERFERin – 1 ml transfection reagent1 x 1 ml9 990 Kčkoupit
409-50INTERFERin – 5 x 1 ml transfection reagent5 x 1 ml36 900 Kčkoupit

 

 

 

Citace:

1. Kodíček, M., (2007) Biochemické pojmy výkladový slovník, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

2. Kontrová, K. et al., (2009) Chem. Listy 103, 302-309 (2009)

3. Birmingham, A. et al., (2006) Nature Methods, Vol.3, No3, 199-204

4. Caffrey, D. et al., (2011) PLoS One. 2011;6(7):e21503. Epub 2011 Jul 5.

 

 

 

Jak stanovovat cytokiny

Jak stanovovat cytokiny

V roce 1957 studovali Alick lsaacs a Jean Lindenmann vliv tepelně inaktivovaného viru chřipky na růst živého viru ve fragmentech kuřecí chorionické chorioallantoické membrány a zjistili, že tepelně inaktivovaný chřipkový virus inkubovaný s membránami produkoval látku, která narušovala infekci a replikaci živého viru.

více informací
5 tipů pro lepší počítání buněk

5 tipů pro lepší počítání buněk

Počítání buněk je únavná práce, kterou je potřeba dělat řádně, ať už v průmyslu nebo na akademické půdě, ať už ručně nebo automatizovaně. Ve všech případech potřebujete obdržet důvěryhodné výsledky, abyste mohli dále pokračovat ve své práci.

více informací
Úvod do světelné mikroskopie se širokým zorným polem

Úvod do světelné mikroskopie se širokým zorným polem

Tento článek má za cíl vysvětlit rozdíly mezi mikroskopem se širokým zorným polem (WF) a konfokálním mikroskopem, zejména pak rozdíly mezi zobrazováním a osvětlením mezi oběma těmito systémy. Rovněž se článek zabývá konfigurací mikroskopů se širokým zorným polem, konkrétně použitých světelných drah a problémy se světlem mimo rovinu zaostření.

více informací